血清特异miRNAs的检测在甲状腺乳头状癌诊断中的意义分析

林安忆 潘华锋 李琰

甲状腺乳头状癌是甲状腺癌中最常见的病理类型，占内分泌恶性肿瘤的70%以上[1-2]。研究指出，甲状腺乳头状癌的发生与微小RNA(miRNA)的表达密切相关，其中miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455均被证实为甲状腺乳头状癌发生的相关miRNA，其在甲状腺组织中表达的上调与疾病的发生密切相关[3-5]。目前，关于miRNA的研究多集中于甲状腺病理标本的表达中，而对于血清miRNA的表达与疾病的关联性研究较少。本研究对血清miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455的检测在甲状腺乳头状癌诊断中的意义进行观察。

对象与方法

一、对象

我院2017年1月～2019年5月收治的甲状腺乳头状癌病人92例，作为研究组，年龄33～65岁，平均年龄(50.93±7.41)岁，男性37例，女性病人55例。对照组92例，为同期正常人群，龄34～62岁，平均年龄(49.18±6.73)岁，男性41例，女性51例。良性组92例，为同期收治的甲状腺良性肿瘤病人，年龄34～64岁，平均年龄(49.92±7.18)岁，男性39例，女性53例。三组受试对象一般资料比较差异无统计学意义。本研究通过伦理委员会审批。纳入标准：(1)符合美国癌症联合委员会关于甲状腺癌的诊断标准[6]，病理切片检查确诊为甲状腺乳头状癌；(2)甲状腺乳头状癌病人中存在不同的浸润程度，包括腺外浸润(肿瘤突破包膜，伴有淋巴管、气道等侵犯)和腺内浸润(肿瘤局限包膜内，不伴有淋巴结转移或器官侵犯)；(3)临床资料完整；(4)签署知情同意书。排除标准：存在其他部位原发性肿瘤；存在心血管、肝、肾等系统严重疾病；随访困难或失访。

二、方法

1.实验方法：(1)提取RNA样本：抽取所有受试对象的晨起空腹静脉血3 ml，以3000 r/min离心15分钟，取上层血清保存，存于-80℃冰箱，后使用天根生化科技(北京)有限公司miRcutemiRNA试剂盒提取所有样本中的总RNA，收集所有RNA样本。(2)引物设计：miRNA-221引物：上游引物为5′-CGAGACTGTGAGAATTACTTGCAAGCTG-3′、下游引物为5′-CCGCTCGAGCATTGGTGAGACAGCCAATG-3′； miRNA-222引物：上游引物为5′-CGCAGATCTTTTCTTCCACAGA-3′、下游引物为5’-GGGGATCCTCTCAGGACACTGAAGC-3′；miRNA-455引物：上游引物为5′-GGGGGTATGTGCCTTTGGAC-3′、下游引物为5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；内参U6引物：上游引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、下游引物为5′-AAAAATATGGAACGCTTCACGAA -3′。(3)获取cDNA：按照miScriptIIRT Kit(QIAGEN)试剂盒步骤获取RNA样本的cDNA，所有cDNA样本全部存于-20℃冰箱，统一进行后续检测。(4)荧光定量PCR：使用赛默飞miRNAqPCR试剂盒进行检测，每个样本需要在qPCR仪上重复检测三次，以U6作为内参，采用2-△△Ct计算miRNA的相对表达量。

2.观察指标：(1)比较三组病人血清miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455的表达情况。(2)比较研究组中不同临床病理特征病人血清miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455的表达情况。(3)血清 miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455表达诊断甲状腺乳头状癌的ROC曲线分析。

三、统计学方法

结 果

1.三组病人血清miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455的表达情况比较见表1。结果表明，研究组病人血清miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455表达均高于对照组差异有统计学意义(P<0.05)。良性组与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 三组病人血清miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455的表达情况比较(2-△△Ct)

注：与对照组相比，aP<0.05，bP>0.05

2.研究组中不同临床病理特征病人血清miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455的表达情况比较见表2。结果表明，年龄超过45岁的病人miRNA-455的表达高于年龄不足45岁的病人，肿瘤直径超过1 cm的病人miRNA-455的表达高于肿瘤直径不足1 cm的病人，单发病灶病人miRNA-455的表达显著高于多发病人，存在淋巴结转移的病人miRNA-221和miRNA-222的表达显著高于无淋巴结转移的病人，出现腺外浸润的病人miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455的表达均显著高于无腺外浸润的病人，差异均有统计学意义(P<0.05)。

3.血清miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455表达诊断甲状腺乳头状癌ROC曲线分析见表3。结果表明，miRNA-221、miRNA-222、miRNA-455在甲状腺乳头状癌诊断中均有一定的价值， ROC曲线线下面积(AUC)分别为0.813、0.802、0.794，P值均为0.000。

表2 研究组中不同临床病理特征病人血清miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455的表达情况(2-△△Ct)

表3 血清miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455表达诊断甲状腺乳头状癌的ROC曲线分析

但是miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455诊断的敏感度和特异度均未>85.0%。

讨 论

甲状腺乳头状癌是较常见的内分泌肿瘤，其发病率逐年升高，临床上常采用穿刺活检法进行诊断，因操作、制作切片技术及读片能力会导致结果不准，且属有创操作，病人不易接受。也有甲状腺乳头状癌血清肿瘤标志物诊断效能的报道[7-8]，但各项指标的特异性较差，目前临床上还未发现一种高灵敏度、高特异度标志物来诊断甲状腺乳头状癌。近年来，miRNA在肿瘤发生发展中的作用逐渐受到重视。有研究发现，miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455均是肿瘤特异标志物，在癌组织中的表达存在明显异常[9-11]。本研究旨在探讨血清miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455的检测在甲状腺乳头状癌诊断中的临床意义。

本研究结果表明，研究组病人血清miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455表达均高于对照组，良性组与对照组比较，差异无统计学意义。miRNA作为一类广泛存在于人体的单链非编码RNA，在基因表达调控中有重要作用，通过和mRNA互补结合，使得转录翻译水平发生抑制，或直接调节mRNA的活性，改变其生理功能[12]。与在甲状腺乳头状癌病人病变组织中的结果一致[13-14]，病人血清miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455的表达明显上调，也发现miRNA表达的差异性。血清miRNA检测在甲状腺乳头状癌诊断中有一定的价值，操作方便易行，病人痛苦小，病人容易接受。研究还发现，在甲状腺乳头状癌病人中，年龄超过45岁、肿瘤直径超过1cm、单发病灶、存在腺外浸润的病人血清miRNA-455的表达升高；存在淋巴结转移和腺外浸润的病人血清miRNA-221和miRNA-222的表达升高。miRNA-455在甲状腺乳头状癌癌组织中的表达上调和病人TNM分期密切相关，同时也与肿瘤直径和淋巴结转移有相关性，血清miRNA的异常则与病人年龄、肿瘤病灶情况以及肿瘤转移情况有相关性，其在ROC曲线分析中的敏感度和特异度均较差，AUC仅为0.794，整体诊断效能并不理想。miRNA-221和miRNA-222可能通过下调基质金属蛋白酶抑制剂以增强癌细胞的转移能力，miRNA-221还可抑制细胞周期依赖性蛋白p27Kipl的表达，p27Kipl在细胞周期的负性调控中具有关键作用，强制表达miRNA-221和miRNA-222可以刺激甲状腺癌细胞打破G1/S周期停滞，从而持续增殖。miRNA-221和miRNA-222是目前多种恶性肿瘤的治疗靶点，其在肝癌、胶质瘤等多种癌症中均存在异常的表达，既往研究提示上述两种miRNA也可作为甲状腺乳头状癌的治疗靶点，同时与肿瘤的侵袭性存在一定的相关性[15]。本研究也提示，血清miRNA-221和miRNA-222与病人肿瘤转移和浸润存在一定的相关性，在诊断甲状腺乳头状癌时，上述两种miRNA的AUC分别为0.813和0.803，其中miRNA-221的诊断灵敏度和特异度更好，整体的诊断效能要优于miRNA-455，在临床诊断中能够帮助判断病人肿瘤转移情况和浸润情况，有利于临床分期，但对肿瘤直径和病灶个数无明显的提示作用。本研究显示，血清miRNA-221和miRNA-222在判断甲状腺乳头状癌方面有一定的价值，但灵敏度和特异度不高。由于本研究为单中心研究，病人的样本量有限，而影响miRNA表达以及检测准确性的因素较多。因此，血清miRNA能否作为甲状腺乳头状癌诊断的标准或对疾病诊断的具体效果需要大样本进一步的分析和验证。

综上所述，血清miRNA-221、miRNA-222和miRNA-455的表达在甲状腺乳头状癌病人中有明显的上调，通过检测miRNA能够初步判断病人肿瘤病灶情况、转移情况以及浸润程度，为临床甲状腺乳头状癌诊断提供一种有效的辅助检查手段。但其诊断的灵敏度、特异度和临床意义仍需要进一步的研究。