1例罕见中间型β地中海贫血基因诊断及家系分析*

任振敏，刘永秋，刘景，刘四喜，李长钢，陈运生

(深圳市儿童医院 a.检验科，b.血液肿瘤科，广东深圳 518038)

β地贫是由于β-珠蛋白基因突变使β-珠蛋白肽链合成不足(β+)或完全缺乏(β0)而引起的溶血性贫血[1]。目前，市场上的试剂盒可以检出在我国常见的17种突变类型，且随着测序技术的发展，可检测的突变类型逐年增加。研究表明，-86突变在我国非常罕见，-86(C>G)杂合突变仅见3例报道[2-4]，而-86(C>A)在我国尚未见报道。本研究检出-86(C>A)复合IVS-Ⅱ-654(C>T)中间型地贫1例，并对其进行基因诊断以及家系分析，报告如下。

1 资料与方法

1.1病历资料 先证者，女，3岁4月因面色苍白、发热、咳嗽于2018年12月来本院就诊。外院血常规检测Hb为54 g/L，查体肝脾肿大。其父亲，云南人，29岁，无贫血症状。其母亲，安徽人，26岁，孕1育1，血常规显示轻度贫血，HbA2为4.5%，疑似β地贫。采集先证者及其父母的空腹静脉血标本进行基因检测,并对该家系进行分析。家系图谱见图1。

注：，母亲(βN/β-86(C>A))；，父亲(βN/βIVS-Ⅱ-654(C>T))；，先证者(βIVS-Ⅱ-654(C>T)/β-86(C>A))。

图1 该患者的家系图谱

1.2主要的仪器与试剂 XS-800i全血细胞分析仪及配套试剂(日本Sysmex公司)；全自动毛细管电泳仪及配套试剂(法国Sebia公司)；KingFisher Flex核酸提取仪(美国赛默飞公司)；PCR扩增仪和凝胶成像系统(德国耶拿分析仪器公司)；电泳仪(美国 Bio-Rad公司)；5430 小型台式高速离心机(德国Eppendorf 公司)；YN-H16 恒温杂交仪和珠蛋白生成障碍性贫血基因检测试剂盒(深圳亚能公司)；核酸提取试剂(广州美基生物公司)。

1.3血液学分析 按照XS-800i全血细胞分析仪及及配套试剂说明书操作检测RBC、Hb、MCV、MCH等血液学参数，RBC参考范围：(3.5～5.5)×1012/L，Hb参考范围：110～160 g/L，MCV参考范围：82～96 fL，MCH参考范围：27～32 pg。按照全自动毛细管血红蛋白电泳仪及配套试剂说明书操作检测Hb A、Hb A2以及Hb F等参数。HbA参考范围：94.5%～96.5%，Hb A2参考范围：2.5%～3.5%，Hb F参考范围：0.26%～2.3%。

1.4突变位点检测

1.4.1DNA提取 采集先证者以及父母就诊时的空腹静脉血各1 mL，EDTA-K2抗凝，充分混匀。取200 μL抗凝血，采用磁珠法，按照KingFisher Flex核酸提取仪及核酸提取试剂说明书操作提取DNA。取吸光度(A260/280 nm)为1.8～2.0的样本用于后续试验，样本置-20 ℃保存。

1.4.2PCR-RDB法检测 采用Gap-PCR法以及PCR-RDB法，按照PCR扩增仪及珠蛋白生成障碍性贫血基因检测试剂盒说明书操作进行PCR扩增及结果判读，检测常规17种β珠蛋白基因突变类型[-28、-29、-30、-32、CD14-15、CD17、CD26(βE)、CD27-28、CD31、CD41-42、CD43、CD71-72、IVS-Ⅰ-1、IVS-Ⅰ-5、IVS-Ⅱ-654、CAP+1、起始密码子(initiation condon)]，排除合并常见α缺失(-α4.2、-α3.7、--SEA)以及常见α突变[αWS(CD122)，CAC-CAG；αQS(CD125)，CTG-CCG；αCS(CD142)，TAA-CAA]。

1.4.3Sanger测序 取先证者及其母亲的静脉血标本500 μL，送深圳亚能公司进行Sanger测序。测序结果与野生型序列进行对比分析，以确定是否存在碱基突变。

2 结果

2.1该家系血常规检测结果 先证者抗感染后表现为中度贫血；其父亲无贫血症状；其母亲表现为轻度贫血(表1)。

表1 先证者及其父母的血液学分析结果

2.2该家系PCR-RDB法检测结果 先证者基因型为βIVS-Ⅱ-654(C>T)/βN，其父亲基因型为βN/βIVS-Ⅱ-654(C>T)，其母亲未见突变。

2.3该家系Sanger测序检测结果 先证者Sanger测序结果为β基因上存在双重杂合突变，α基因未见突变。其母亲Sanger测序结果为β基因上存在1个罕见突变，α基因未见突变。测序结果见图2。根据血常规以及血红蛋白电泳的结果，其父亲未进行测序检测。

3 讨论

中间型β地贫常见的基因型为β0/β+或者β+/β+，临床表现具有异质性，轻症者仅表现为轻度贫血，重症者需常年输血[5]。本研究发现的-86(C>A)突变位于高度保守的近端启动子CACCC序列，此序列是EKLF(erythroid Krüppel-like factor)的红细胞特异性结合位点。EKLF作为一种锌指转录因子，在红细胞生成和β珠蛋白转换调节中具有重要的作用。研究表明，该位点突变可破坏EKLF的结合，从而引起轻型β地贫(β+)[6]。此外，IVS-Ⅱ-654也可引起轻型β地贫(β+)，本例先证者(β+/β+)平日血常规表现为中度贫血，至本院初诊时因为存在感染情况，表现为重度贫血，感染控制后恢复为中度贫血。另有文献报道-86(C>G)纯合子(β+/β+)仅表现为轻度贫血[7]。而本例先证者(β+/β+)表现为中度贫血，表明临床表型不仅仅取决于基因型，还可能与种族差异性和遗传修饰有关[8]。

笔者进一步行流行病学调查结果发现，先证者的母亲籍贯为安徽，居住地为江苏徐州，均不属于地贫高发区，故而轻度贫血症状在其怀孕期间并未引起重视。先证者出生后在居住地医院就诊时也是首先考虑为缺铁性贫血进行治疗。有学者报道，HbA2在筛查轻型β地贫中具有较高的敏感性和特异性[9-10]。故而推测，先证者母亲如果早期进行Hb电泳检查，或可发现HbA2升高，并结合其父亲的地贫结果，从而进行产前诊断。本例先证者的HbA2表达水平升高，与常规检出的轻型地贫类型相符，但是其HbF为28%，提示可能是中间型地贫。目前临床上常规的地贫基因检测试剂盒不能覆盖所有的中国人突变类型。随着检测技术的进步，可检测到的突变类型尤其是一些稀有类型突变逐年增加[11]。但目前测序技术价格昂贵，仍然无法普及至边远地区，所以要重视血常规以及血红蛋白电泳等地贫筛查，如发现基因型与表型不一致的情况下，要做进一步检测，以避免漏诊。

注：A，先证者-86(C>A)HBB:c.-136C>A；B，先证者IVS-Ⅱ-654(C>T)HBB:c.316-197C>T;C,先证者母亲-86(C>A)HBB:c.-136C>A。

图2 该家系β珠蛋白基因Sanger测序结果