RNA干扰长链非编码RNA 肺腺癌相关转录本1影响BIU-87细胞的增殖

桑赫男

(抚顺市中心医院检验科，辽宁抚顺113006)

膀胱癌是临床上常见的泌尿系统恶性肿瘤，主要发生于膀胱黏膜的上皮，是常见恶性肿瘤之一[1]。膀胱癌的发病原因可能与遗传和外在环境有关[2]，但是其确切的发病机制目前尚不明确[3]。肺腺癌相关转录本1(MALAT1)为长链非编码RNA(lncRNA)的重要成员，有学者发现，其与肿瘤细胞的增殖及凋亡过程密切相关[4]。基质金属蛋白酶及其抑制剂调控细胞外基质的重构过程，且其表达异常与肿瘤细胞的转移密切相关。BIU-87细胞来源于人膀胱乳头状移行上皮癌，为上皮样贴壁细胞。本研究旨在分析RNA干扰MALAT1是否通过抑制基质金属蛋白酶的表达，从而影响膀胱癌细胞系BIU-87的细胞增殖，以期为膀胱癌的临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1细胞系、主要试剂及仪器 膀胱癌细胞系BIU-87购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；MALAT1-RNAi表达载体(由本实验室保存)；RPMI培养基(美国Hyclone公司)；MTT试剂(美国Sigma Aldrich公司)；兔抗人MMP2抗体(美国R&D公司)；兔抗人MMP9抗体(美国Santa Cruz公司)；兔抗人TIMP1及兔抗人TIMP2抗体(美国Cell Signaling公司)；HRP标记的羊抗小鼠/羊抗兔IgG二抗(北京中杉金桥公司)；其余试剂为市售分析纯。电泳槽、电泳仪及蛋白质转移系统均购自美国ABI公司；Multiskan Sky紫外分光光度仪(美国赛默飞世尔公司)。

1.2细胞转染 取生长状态良好的膀胱癌细胞系BIU-87，分别设为空白对照组(n=8)、阴性对照组(n=8)和转染组(n=8)，其中空白对照组细胞不进行处理，阴性对照组细胞仅转染空载体，转染组构建MALAT1-RNAi表达载体(细胞融合度达80%时，室温温育20 min，转染复合物置于培养箱培养6 h后更换培养基)。分别收集转染后的各组细胞，加入含青霉素(终浓度100 U/mL)、链霉素(终浓度100 U/mL)和FBS(终浓度10%)的RPMI-1640培养液，置于37 ℃、5%CO2、95%相对湿度恒温培养箱中分别培养12、24及48 h，收集细胞并用于后续试验。

1.3MTT试验 取上述3组培养12、24和48 h后的细胞(细胞融合度达80%)，弃去培养液，分别加入200 μL MTT溶液，继续温育4 h，采用Multiskan Sky紫外分光光度仪检测490 nm处的吸光度(A490 nm)值，并计算各组细胞的抑制率。公式：抑制率=(对照组A490 nm值-试验组A490 nm值)/对照组A490 nm值×100%。

1.4细胞蛋白质提取 收集1.2中转染后的3组细胞(各3×105个)，无菌PBS(4 ℃预冷)洗涤2次，800×g离心5 min去除上清，吸净残留液体，加入含1%蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液，并于冰水浴中进行充分研磨匀浆。采用考马斯亮蓝法测定样本的蛋白质浓度。然后加入1/3体积的4×SDS蛋白质上样缓冲液，煮沸10 min，分装并置-20 ℃保存。

1.5western blot 配制10% SDS-PAGE分离胶，按总蛋白量200 μg进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(积层胶采用80 V电压，分离胶采用100 V电压)。电泳结束后在350 mA恒流条件下2 h将蛋白质转移至硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane,NC)上。转膜结束后将膜置于50 g/L脱脂奶粉中室温封闭4 h，加入兔抗人MMP2抗体(1∶400稀释)、兔抗人MMP9抗体(1∶500稀释)、兔抗人TIMP1及TIMP2抗体(1∶500稀释)温育过夜。无菌PBS洗膜3次，每次5 min，加入HRP标记的羊抗小鼠/羊抗兔IgG二抗(1∶200稀释)37 ℃温育2 h。无菌PBS洗膜后，采用凝胶成像分析系统及配套软件对条带进行灰度扫描及结果判读，以β-actin蛋白作为内参照，试验重复3次。

1.6细胞划痕试验 收集转染后的3组BIU-87细胞(约3×105个)，接种于6孔细胞培养板中，加入含青霉素(终浓度100 U/mL)、链霉素(终浓度100 U/mL)和FBS(终浓度10%)的RPMI-1640培养液，置于37 ℃、5%CO2的恒温培养箱中培养，待细胞融合度达80%时，更换无血清DMEM培养基进行培养。每个细胞培养孔用Tips移液枪头划出3道竖线，光学显微镜下观察并拍照0 h时的细胞形态。以按照1.2处理24 h后的细胞形态作为计算迁移率的终点状态。根据划痕面积，采用Image J软件计算细胞迁移率。

2 结果

2.1lncRNA MALAT1对BIU-87细胞增殖的影响 与空白对照组和阴性对照组相比，转染组膀胱癌细胞系BIU-87的增殖能力受到明显抑制(P<0.05)，且随着作用时间的延长，其抑制率明显升高(P<0.05)，见表1。此外，与空白对照组和阴性对照组相比，转染组细胞的迁移能力明显降低，差异有统计学意义(χ2=2.657，P=0.000)，见图1。

表1 lncRNA MALAT1对BIU-87细胞增殖能力的影响

注：*，与空白对照组相比，P<0.05；#，与阴性对照组相比，P<0.05。

注：*，与空白组相比，P<0.05；#，与阴性组相比，P<0.05。

图1 3组细胞迁移能力检测结果

2.2lncRNA MALAT1对基质金属蛋白酶及抑制剂表达的影响 western blot检测结果表明，与空白对照组和阴性对照组相比，转染组基质金属蛋白酶MMP2及MMP9蛋白的表达水平明显减弱(P<0.05)。此外，与空白对照组和阴性对照组相比，转染组基质金属蛋白酶抑制剂TIMP1及TIMP2的表达水平亦明显减弱(P<0.05)，见表2、图2。

图2 western blot检测3组细胞基质金属蛋白酶及其抑制剂蛋白的表达

表2 lncRNA MALAT1对BIU-87细胞基质金属蛋白酶及其抑制剂表达变化分析

指标空白对照组阴性对照组转染组FPMMP20.56±0.140.55±0.120.30±0.07∗#28.4750.003MMP90.48±0.090.49±0.100.36±0.07∗#33.6450.001TIMP10.44±0.100.43±0.080.32±0.09∗#36.7540.002TIMP20.47±0.070.48±0.110.39±0.09∗#25.8250.004

注：*，与空白对照组相比，P<0.05；#，与阴性对照组相比，P<0.05。

3 讨论

目前尚未完全阐明膀胱癌发病的分子机制，临床上也无特效的治疗手段，但有证据显示MALAT1与肿瘤的侵袭能力等有关。最新的研究发现，下调MALAT1可靶向促进miR-146b-5p表达，抑制膀胱癌细胞侵袭、迁移能力和上皮间质转化(EMT)[5]。另有学者发现，MALAT1与miR-205之间存在双向抑制关系，MALAT1可通过抑制miR-205的表达来促进骨肉瘤细胞的侵袭[6]。莫美绒等[7]研究表明，LncRNA MALAT1在胶质母细胞瘤中表达下调，过表达lncRNA MALAT1可抑制胶质母细胞瘤细胞增殖和侵袭，并证实其作用机制可能与MMP-2及pERK1/2蛋白表达下调有关。赵志新等[8]通过实验证实，在胶质瘤细胞中MALAT1可通过调控miRNA124的表达，引起CREB基因转录和蛋白质表达水平的升高，从而促进C6胶质瘤细胞增殖。本研究结果也表明，与空白对照组和阴性对照组相比，转染组膀胱癌细胞系BIU-87的增殖受到明显抑制，且随着作用时间的延长其抑制率明显升高，提示RNA干扰MALAT1可能通过抑制基质金属蛋白酶的表达，影响膀胱癌细胞系BIU-87的增殖功能。

基质金属蛋白酶是调控肿瘤细胞转移过程中细胞外基质重构的关键酶，其参与调控了肿瘤细胞的转移和凋亡等过程[9]。本研究结果亦证实，转染组膀胱癌细胞系BIU-87的基质金属蛋白酶及其抑制剂的表达水平明显减弱。然而，本研究未对MMPs/TIMPs蛋白活性进行研究，在今后的研究中，我们将进一步采用明胶酶谱等试验进行相关蛋白质的活性分析，同时采用相关的抑制剂和基因敲除技术进行基因层面的检测分析，以期为相关机制的探讨提供更多思路，为更准确阐明lncRNA MALAT1的作用机制提供实验依据。