1例遗传性异常纤维蛋白原血症导致胎停育*

罗莎莎，杨丽红，谢海啸，金艳慧，刘斯奇，张海月，王明山

(温州医科大学附属第一医院医学检验中心，浙江温州325015)

遗传性异常纤维蛋白原血症(congenitaldysfibrinogenemia,CD)是一种纤维蛋白原基因缺陷致纤维蛋白原分子结构和功能异常的遗传性疾病，主要与FGA、FGB和FGG3种基因突变有关，多数为常染色体显性遗传，少数为常染色体隐性遗传[1]。该病临床表现高度异质性,其中约55%患者无临床表现，25%患者有出血症状，20%患者有血栓形成，少数患者表现为伤口愈合不良、反复流产等[2]。纤维蛋白原(fibrinogen,Fg)对于妊娠期胎囊的植入和胎盘形成至关重要，在妊娠期，Fg通过支持细胞和滋养细胞播散，促进母体和胎儿间的血管生成，从而维持胎盘的完整性[3]。因此，遗传性异常纤维蛋白原血症患者在妊娠期最常见的并发症为复发性流产、胎盘早剥、产后出血及血栓形成等[4]。本研究分析了1例遗传性异常纤维蛋白原血症家系的临床表型和基因型，并深入探讨突变基因与胎停育之间的关系。

1 对象与方法

1.1研究对象 先证者，女，33岁，汉族，7年前生育1男孩。现怀孕6周+5 d，此前3年内有不明原因胎停育2次，第一次孕5周+6 d，第二次孕+3 d，2018年2月至我院门诊要求进行相关检查。凝血常规检查示凝血酶时间(thrombin time，TT)明显延长(34.4 s/17.0 s)，Fg活性(Fg activity，Fg:C)显著降低(1.02 g/L)，血小板计数及肝肾功能指标正常。患者自述既往月经规律，无其他明显自发出血症状，无血栓史，无肝肾功能异常史。否认父母近亲婚配及其家系成员出血史。采集先证者及其家系3代共6名成员的外周血标本。

1.2主要仪器与试剂 STA-R全自动血凝仪及原装配套试剂(法国Stago公司);LX20PRO 全自动生化分析仪(美国Beckman公司);2720型PCR扩增仪(美国ABI公司);凝胶电泳仪(美国Bio-Rad公司);凝胶成像系统 (上海天能公司);Fg抗原(Fg antigen，Fg:Ag)检测试剂盒(浙江伊利康生物公司)；DNA提取试剂盒(上海荻硕贝肯生物公司)；PCR扩增试剂盒(美国Promega公司)。

1.3标本采集与处理 采集受试者治疗前外周静脉血2.7 mL，用0.109 mol/L枸橼酸钠1∶9抗凝；3 000 r/min离心15 min，上层乏血小板血浆用于各凝血指标及Fg:Ag含量的检测，2 h内检测完毕。下层血细胞用于提取基因组DNA及PCR扩增测序，置于-40 ℃保存。

1.4实验室表型指标检测 采用凝固法，按照STA-R全自动血凝仪及原装配套试剂说明书检测血浆凝血酶原时间(prothrombin time，PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)、TT、Fg:C；采用免疫比浊法检测D二聚体(D-Dimer,D-D)和纤维蛋白(原)降解产物(fibrin degradation products，FDPs);采用免疫比浊法，按照LX20PRO全自动生化分析仪及Fg抗原(Fg antigen，Fg:Ag)检测试剂盒说明书检测Fg:Ag含量。均按照试剂盒说明书进行结果判读。

1.5全血基因组DNA提取 采用高盐法，按照全血基因组DNA提取试剂盒说明书提取先证者及其家系成员的外周血基因组DNA，用DU800核酸蛋白分析仪检测基因组DNA产物的纯度和浓度，取纯度(A260/280 nm约1.9)和浓度为50 ng/μL的DNA产物，置-40 ℃保存。

1.6纤维蛋白原基因检测 根据FGA、FGB、FGG基因在GenBank中的参考序列号(分别为M64982、M64983和M10014)，利用Primer Primer 6.0TM软件结合参考文献[5]设计覆盖Fg基因所有外显子及其侧翼序列的引物，引物由上海桑尼公司合成，引物序列见表1。PCR反应体系为50 μL，包括Taq PCR MasterMix(含染料)25 μL，双蒸水18 μL,DNA模板3 μL，10 μmol/L上、下游引物各2 μL。扩增条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s,55 ℃或56 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外光下观察为单一明亮条带。送上海桑尼生物公司(测序仪为ABI PRISM 3730)进行正、反向测序。测序结果用Chromas和DNAMAN软件进行分析，并与NCBI中公布的FGA、FGB、FGG基因在GenBank中的参考序列进行比对，寻找基因突变位点，发现突变基因后，通过反向测序进行验证。明确先证者基因突变位点后，再扩增家系其他成员的相应区域并进行测序分析。

2 结果

2.1先证者及家系成员血浆实验室表型指标检测结果 先证者血浆PT、APTT、D-D和FDPs检测结果正常，TT显著延长为34.4 s/17.0 s，Fg:C降低至1.02 g/L，Fg:Ag在参考范围内(2.0～4.0 g/L)。先证者母亲、弟弟及儿子的检测结果与先证者相似。先证者父亲和丈夫的所有上述检测结果均在参考范围内。见表2。

表1 FGA、FGB、FGG基因的引物序列及扩增片段长度

表2 先证者及家系成员的临床表型检测结果

2.2基因检测结果FGA、FGB和FGG基因外显子和侧翼序列测序结果显示，先证者FGG基因第8外显子存在g.7476G>A杂合错义突变，导致第275位的精氨酸(Arg)被组氨酸(His)取代(p.γArg275His)；FGB基因第8外显子存在g.7652G>A杂合多态性，导致第478位的精氨酸(Arg)被赖氨酸(Lys)取代(p.BβArg478Lys)。家系成员中，先证者的母亲、弟弟和儿子均存在g.7476G>A杂合错义突变，先证者的父亲为g.7652G>A杂合多态性。见图1、2。

注：，先证者；，Arg478Lys多态性;,Arg275His杂合突变；，Arg275His杂合突变和Arg478Lys多态性。

图1 遗传性异常纤维蛋白原血症家系图

注：A，FGG基因第8外显子g.7476G>A杂合错义突变；B，FGG基因第8外显子野生型；C，FGB基因第8外显子g.7652G>A杂合多态性；D，FGB基因第8外显子野生型。

图2 该先证者Fg基因测序结果

3 讨论

Fg由簇集于4q31染色体约50 000 bp内的3 个独立基因(FGA、FGB、FGG)所编码的3条肽链 (Aα、Bβ、γ)组成的六聚体，相对分子质量约为340 000，是血浆中含量最高的凝血因子。Fg主要在肝细胞中合成，少部分在上皮细胞中合成，其主要生理功能为进入血液循环后参与凝血和调节纤溶，因此Fg异常往往导致各种出凝血疾病。遗传性纤维蛋白原异常患者在妊娠期最常见的并发症为反复自然流产、胎盘早剥等。Frenkel等[6]曾报道2例遗传性低纤维蛋白原血症孕妇在分娩时均发生胎盘早剥。本研究发现先证者FGG基因第8号外显子存在p.γArg275His杂合错义突变和p.BβArg 478 Lys杂合多态性。γArg275位于D-D接触面，D-D结合是形成纤维蛋白网架结构所必须。γ链275Arg被His替换，会引起D-D连接区域结构的改变，进而影响纤维蛋白单体聚合，导致异常纤维蛋白原血症。Arg478Lys是纤维蛋白原FGB基因较常见的多态性之一，BβArg478Lys位置靠近以下区域：预测的β链聚合点，β链的钙离子结合部位以及β链和α链羧基端结合部位，这3个区域是纤维蛋白原聚集的重要部位。

蒋丽娅等[7]对1例遗传性异常纤维蛋白原血症患者的FGG基因突变分析发现，p.γArg275His错义突变是导致异常纤维蛋白原血症的主要原因。此外，在已报道的γArg275His病例中约27%患者有血栓形成，该突变将导致纤维蛋白肽释放，纤维蛋白单体聚合，纤维蛋白交联或纤维蛋白溶解的改变，可引起出血或血栓形成性疾病。Ajjan等[8]对p.BβArg 478Lys多态性研究发现，Lys478的纤维蛋白溶解率明显低于Arg 478，提示Lys 478纤维蛋白具有纤维薄、孔小的特点，表现出较强的硬度，对纤溶功能有较强的抵抗力，形成的纤维蛋白不容易降解，增加血栓形成的风险。本研究中的先证者同时存在p.γArg275His杂合错义突变和p.BβArg478Lys杂合多态性，其所发生的胎停育现象推测与p.γArg275His杂合错义突变和p.BβArg478Lys杂合多态性有关。

研究显示，纤维蛋白原FGG基因敲除小鼠妊娠不能维持至足月[9]，表明纤维蛋白原对妊娠的重要性。妊娠期间纤维蛋白凝块结构改变均会造成不良妊娠[10]。受精卵着床后子宫螺旋动脉开始不断被滋养细胞侵蚀，导致管腔扩大，为满足妊娠时期的血氧供应，子宫动脉血流阻力进行性降低[11-12]。在早孕时期，若子宫动脉血流灌注不足，即可能导致自然流产、胎儿生长受限、胎盘早剥、子痫前期、胚胎停育等不良妊娠结局[13]，如果子宫动脉血流灌注在早期能够得到纠正，妊娠结局就会显著改善。因此，母体中纤维蛋白原含量和功能是否正常对妊娠至关重要。该先证者Fg:Ag含量正常，但Fg:C降低，为Ⅱ型Fg缺陷症患者，即异常纤维蛋白原血症。由于Fg结构发生了改变，妊娠导致生理性高凝状态所产生的纤维蛋白不易被纤溶酶溶解，子宫螺旋动脉血流阻力进行性升高，供应胎儿的血流减少，氧气和营养物质无法满足胎儿生长发育的需要，从而可能导致胎停。

综上所述，本研究分析了p.γArg275His杂合错义突变和p.BβArg478Lys杂合多态性导致该先证者胎停育的可能机制。对于临床上出现胎停育的妇女进行易栓症的筛查和基因突变分析，查找原因，对症治疗，是预防再次出现胎停育的有效措施。但由于这只是1个家系先证者的临床表现，还有待于分析更多的病例以期为临床提供依据。