NaH催化合成3,4-二氢-2H-吡嗪并[2,1-b]喹唑啉-1,6-二酮及其抗肝癌细胞活性评价

葛维娟，孟 歌，谢紫轩，陈 萍，白 宏

(1.西安培华学院医学院，陕西 西安 710125；2.西安交通大学药学院，陕西 西安 710061;3.复旦大学化学系手性分子合成工程中心，上海 200433)

稠合氮杂环普遍存在于多种天然产物中，在制药工业和材料科学中发挥着重要作用[1-2]。特别是稠合的喹唑啉-4-酮是制备大量具有显著生物活性的生物碱类化合物的重要骨架[3-4]。大约有150种天然的生物碱类化合物中含有稠合的喹唑啉-4-酮结构片段，其中很多稠环结构具有抗肿瘤活性，如色胺酮(Tryptanthrine)[5]、达尼喹酮(Batracyclin)[6]、鸭嘴花碱酮(Vasicinone)[7]、骆驼宁碱A(Luotonin A)[8]、吴茱萸次碱(Ruteacarpine)和吴茱萸碱(Evodiamine)[9]等。这些化合物具有类似的三环稠和喹唑啉杂环体系，包括A、B和C环,它们共有的主要结构骨架就是2,3-稠合的(3H)-喹唑啉-4-酮，结构如图1所示。

图1 具有稠合(3H)-喹唑啉-4-酮结构片段的代表性生物活性化合物Figure1 Representative bioactive compounds bearing fused quinazolin-4(3H)-ones as a structural fragment

虽然2,3-稠合(3H)-喹唑啉-4-酮类化合物是许多天然产物结构改造的核心，但由于合成难度较大，对此类环体系的合成及活性研究较少。例如，法国科学家Thierry Besson课题组[10]曾试图以2-氨基苯甲酸(1)为原料，通过特殊试剂Appel盐(4,5-二氯-1,2,3-二硫代鎓盐氯化物，2)合成所设计的目标化合物3,4-二氢-2H-吡嗪并[2,1-b]喹唑啉-1,6-二酮(10)，却只得到了亚氨基取代产物(4)，没能如期获得目标化合物，合成路线如图2所示。

图2 Thierry Besson课题组假设的化合物(10)的合成路线Figure2 Hypothetic synthetic route of compound (10) by Thierry Besson’s research group

本文经过反复探究，设计了一种合成化合物(10)的新方法，合成路线如图3所示。以邻氨基苯甲酰胺(5)为原料，通过与草酸二乙酯经分子间环合得到中间体(6)[11]，中间体(6)经二溴乙烷烷基化反应得到中间体(8)[12]，中间体(8)经乙酯基的氨解反应得到中间体酰胺(9)[13]，中间体酰胺(9)经分子内环合得到目标产物(10)[14]。所有新化合物结构经1H NMR和MS(ESI)确证，并采用MTT法对目标物进行初步的抗肝癌细胞活性研究。

图3 化合物(10)的合成路线Figure 3 Synthetic route of compound (10)

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

德国布鲁克公司AVANCF-300 MHz型核磁共振仪，DMSO-d6或CDCl3为溶剂，TMS为内标；GC/MS-QP2010气-质联用仪；XT-4型双目显微熔点仪；酶标仪；二氧化碳培养箱。

邻氨基苯甲酰胺、草酸二乙酯、二溴乙烷、氨甲醇溶液(7 N)、氢化钠、N，N-二甲基甲酰胺、石油醚、乙酸乙酯、碳酸钾、浓盐酸、四氢呋喃，所用试剂和溶剂均为分析纯。

人肝癌细胞(SM-7721)，舒尼替尼阳性对照药。

1.2 化合物的合成

1.2.1 (6)的合成

将草酸二乙酯50 mL(0.366 mol)分批加入融化的邻氨基苯甲酰胺(5)6.8 g(0.05 mol)中，回流反应48 h(TLC跟踪)。反应完全后，减压蒸干过量的草酸二乙酯。所得白色固体用冷的乙醇洗涤，过滤后滤饼在冷乙醚中搅拌0.5 h，过滤得细小白色针状晶体(6)8.6 g，收率78.9%，熔点(190～191) ℃ [文献[11]为(190～192) ℃]。

1.2.2 (8)的合成

称取(6)2.18 g(10.0 mmol)和碳酸钾1.52 g(11.0 mmol)，溶解于干燥N，N-二甲基甲酰胺(50 mL)中，室温搅拌下，滴加1,2-二溴乙烷2.06 g(11 mmol)，30 min滴加完毕，室温反应4 h(TLC跟踪)。过滤除去碳酸钾，并向滤液中加水200 mL，用乙酸乙酯(3×100 mL)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋蒸得到淡黄色油状物。经硅胶柱层析[洗脱剂：V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=5∶1)]纯化得无色油状物，加入少量的乙醇和适量的水，超声条件下析出白色固体(8)2.50 g，收率76.9%，熔点(73～74) ℃。1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ(ppm):8.32(d,J=7.9Hz,1H),7.81(d,J=3.5Hz,2H),7.59(dd,J=7.7,4.3Hz,1H),4.64～4.45(m,4H),3.86(t,J=6.5Hz,2H),1.48(t,J=7.1Hz,3H)。MSm/zcalculated for C13H13BrN2O3[M+H]+325.16,found 326.1。

1.2.3 (9)的合成

称取中间体(8)1.30 g(4.0 mmol)于一个50 mL的圆底烧瓶中，分批加入氨的甲醇溶液8.0 mL (7 N)，室温搅拌过夜(TLC跟踪)。待反应完全后，将反应液倾入冰水(40 mL)中搅拌10 min。用浓盐酸调节pH值为5～6，得到大量白色沉淀，抽滤并用水洗涤滤饼，真空干燥得白色固体(9)1.04 g, 收率为88.14%，熔点(171～173) ℃。1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ(ppm):8.32(d,J=8.0Hz,1H),7.81(t,J=7.6Hz,1H),7.72(d,J=8.1Hz,1H),7.59(t,J=7.5Hz,1H),7.52(s,1H),5.84(s,1H),4.97(t,J=6.5Hz,2H),3.90(t,J=6.5Hz,2H)。MS(EI)m/zcalculated for C11H10BrN3O2[M+H]+. 296.12, found 216.1(MS-Br)。

1.2.4 (10)的合成

称取化合物(9)0.89 g(3.0 mmol)溶解于四氢呋喃(25 mL)中，在(-5～0) ℃缓慢加入0.24 g(6.0 mmol)的60%NaH，室温条件下搅拌1 h(TLC跟踪)。待反应完全后，将混合物减压浓缩，加入冰水淬灭反应，过滤得到白色粗产物，用冷水、石油醚依次洗涤滤饼得到目标化合物(10)0.56 g，收率为86.8%,熔点>300 ℃。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ(ppm):8.91(s,1H),8.18(d,J=7.7Hz,1H),7.89(t,J=7.2Hz,1H),7.82(d,J=8.0Hz,1H),7.63(t,J=7.4Hz,1H),4.22(m,2H),3.55(t,2H)。MSm/zcalculated for C11H9N3O2[M+H]+215.21, found 215.1。

1.3 抗肝癌细胞活性测定

以舒尼替尼(sunitinib)为阳性对照药，肝癌细胞系SMMC-7721作为受试细胞株，采用MTT比色法初步测试目标化合物(10)体外抗肝癌细胞活性[15]。

肝癌细胞系SMMC-7721以含10%胎牛血清的DMEM培养基(Corning cat no. 10017236R)，37 ℃、5%CO2培养箱培养至对数生长期，然后以0.02%EDTA-0.25%胰酶37 ℃消化2 min，1 000 rpm离心5 min收集细胞，制备1×105/mL细胞悬液，按100 μL/孔将细胞接种于96孔细胞培养板，37 ℃、5%CO2培养箱过夜培养细胞。将所测试的化合物(10)以二甲基亚砜配置为100 mmol·L-1贮存液，分别按(0～50) mmol·L-1系列浓度梯度进行加药处理，并设对照组，均设3个复孔，总体积200 μL/孔，继续37 ℃、5%CO2培养细胞24 h、48 h、72 h。每孔加入20 μL/孔MTT(5 mg·mL-1), 继续培养(3～4) h，移除培养液，加150 μL/孔二甲基亚砜，室温下振荡15 min，用酶标仪(λ=490 nm)测定待测液的吸光度值，分别在24 h、48 h、72 h测定并记录产物对SMMC-7721细胞抑制活性。将抑制率与对应的药物浓度数据输入GraphPad Prism7.00软件中，拟合抑制率变化曲线并计算半数抑制浓度(IC50)值。

2 结果与讨论

2.1 化合物的合成

目标化合物(10)三个环的构建经过四步完成。其中第一步按照文献报道的方法比较容易获得了中间体(6)，从而构建了A环和B环。该合成路线的新颖之处在于通过后续三个步骤构建C环。尽管每一步类似反应的具体方法和条件已在文献中报道，但用于构建这种特殊骨架的整体合成路线尚未报道。这种新设计的合成路线是我们研究小组首次提出并成功验证，并且已在其他相关稠环系统的合成中得到实践。

在探索这种合成路线的过程中，也遇到许多困难。首先，为了获得关键的中间体羧酰胺(9)，我们最初设计了另一种替代方法(见图3)，即将中间体(6)先经过氨甲醇氨解得到羧酰胺中间体(7)，然后尝试通过将(7)与1，2-二溴乙烷进行常规烷基化来获得羧酰胺(9)，但无论用何种碱性催化剂(包括碳酸钾和氢化钠)，都无法得到所需烷基化产物。猜想羧酰胺(7)的惰性性质可能与喹唑啉上3-NH的正电子密度比羧酸酯(6)更高，因为随后(6)通过烷基化试剂成功转化为中间体(8)，然后(8)经氨解又成功得到了中间体(9)。

合成路线的最后一步对我们研究小组来说是一项艰巨的任务，就像Thierry Besson小组的相关类似研究工作一样。为了获得化合物(10)，最初尝试在室温下用碳酸钾对羧酰胺(9)进行分子内环化，在连续反应15 h的TLC分析中未检测到任何新产物，在油浴上升高反应温度也不能改善反应过程。经过反复试验，考虑到催化碱的碱性可能太弱，于是选择了碱性更强的氢化钠作为催化剂，室温条件下反应1 h，成功获得目标化合物(10)，总收率46.5%。受此结果鼓舞，设想在相同的NaH条件下，是否可以通过(7)和二溴乙烷之间的一步分子间缩合直接获得化合物(10)，但实验结果表明，这种方法无法获得目标产物(图3)。

2.2 抗肝癌细胞活性

将化合物(10)通过配制成0 mmol·L-1、0.781 3 mmol·L-1、1.562 5 mmol·L-1、3.125 mmol·L-1、6.25 mmol·L-1、12.5 mmol·L-1、25 mmol·L-1、50 mmol·L-1共8个浓度，分别处理细胞株24 h、48 h、72 h,以舒尼替尼(sunitinib)为阳性对照药，同法处理。采用MTT比色法测定其抗增殖作用，结果如图4所示。 由图4可以看出，肝癌细胞经8个不同浓度的化合物(10)作用24 h 后，细胞生长均受到抑制，但只有在浓度为50 mmol·L-1时，其对肝癌细胞抑制率优于阳性对照组，有极显著差异(P<0.001)。化合物(10)与肝癌细胞作用48 h后,浓度分别为25 mmol·L-1、50 mmol·L-1时，其对肝癌细胞抑制率高于阳性对照组，有极显著差异(P<0.001)。化合物(10)与肝癌细胞作用72 h后,在浓度为0.781 3 mmol·L-1时，其对肝癌细胞抑制率高于阳性对照组，有显著差异(P<0.01)；在浓度为1.562 5 mmol·L-1时，其对肝癌细胞抑制率高于阳性对照组，存在极显著差异(P<0.001)；在浓度为3.125 0 mmol·L-1时，其对肝癌细胞抑制率高于阳性对照组，有显著差异(P<0.05)；而在其余的浓度条件下，与对阳性对照组相比,发现抑制率没有明显变化。

图4 化合物(10)与舒尼替尼对SMMC-7721细胞系的生物抑制活性对比图Figure 4 Biological inhibitory activity comparision of compound 10 with sunitinib against SMMC-7721 cell line

在GraphPad Prism7.00软件中，拟合抑制率变化曲线并计算了化合物(10)、舒尼替尼对SMMC-7721细胞系分别在24 h、48 h和72 h的半数抑制浓度(IC50)值，结果如表1所示。由表1可以看出，化合物(10)在24 h、48 h和72 h的IC50值均小于阳性对照组，初步表明化合物(10)是一种很有前途的新型抗肝癌药物先导化合物。

表1 化合物(10)、舒尼替尼对SMMC-7721细胞系分别在24 h、48 h和72 h的IC50值(mmol·L-1)

3 结 论

(1)以天然产物所共有的三环稠合喹唑啉结构模板，开发了一种有效的构建2,3-稠合的(3H)-喹唑啉-4-酮骨架的方法，经过分子间环合、烷基化、氨解、分子内环合四步化学反应合成出一个结构新颖的3,4-二氢-2H-吡嗪并[2,1-b]喹唑啉-1,6-二酮化合物(10)，并采用MTT法初步评价其体外抗肝癌活性。

(2)化合物(10)对肝癌细胞系SMMC-7721具有明显的抑制活性，优于阳性对照药舒尼替尼，为进一步发现新型抗肿瘤药物提供先导结构，也为该类衍生物的大量合成和结构改造提供参考方法。