线粒体钙离子摄入蛋白1在肾透明细胞癌组织中的表达及其临床意义

何元方陈艳琴杨涛张召辉刘晓斌，4

作者单位：716000延安 1延安大学医学院；710038西安 2空军军医大学唐都医院疼痛科；221004徐州 3徐州医科大学附属淮海医院普通外科；716000延安 4延安大学附属医院检验科

肾透明细胞癌（renal clear cell carcinoma，RCCC）是泌尿系统常见的恶性肿瘤，占肾脏恶性肿瘤的85%～90%［1］。目前RCCC尚缺乏有效的早期筛查手段，约30%的患者在诊断时已发生转移［2］。由于晚期患者的手术治疗效果不佳，转移性RCCC患者的5年生存率＜10%［3］。因此，迫切需要进一步开发针对RCCC的新型分子诊断和预后评估的生物标志物。线粒体Ca2+稳态是细胞代谢和功能的关键控制者。研究表明线粒体Ca2+信号的异常可促进多种恶性肿瘤的发生发展［4］。目前有研究发现，线粒体钙离子摄入蛋白1（mitochondrial calcium uptake 1，MICU1）在卵巢癌、结肠癌和前列腺癌中异常表达，且与肿瘤进展密切相关［5-8］，但其是否可作为RCCC预后标志物仍需进一步研究。本研究通过分析MICU1在RCCC组织中的表达及其与总生存期的关系，旨在阐明MICU1在RCCC中的作用。

1 材料和方法

1.1 标本来源

收集2016年1月—2018年12月于延安大学附属医院行根治性肾切除术的RCCC患者的石蜡包埋切片30例，同时选取距离肿瘤边缘5 cm以上且经病理检查无癌细胞的癌旁组织为对照。患者纳入标准：⑴经病理证实为RCCC；⑵术前未接受化疗或放疗。排除在研究期间接受药物治疗以及合并其他恶性肿瘤或其他重大疾病者。本研究经延安大学附属医院伦理委员会批准，患者知情同意。

1.2 主要试剂与仪器

RCCC细胞株CAKI-1购自中科院上海细胞库；MICU1真核表达质粒和干涉片段由空军军医大学生理与病理学教研室提供；胎牛血清购自BBI Life Sciences公司；青链霉素混合液购自中国索莱宝公司；RPMI 1640培养基及DMEM高糖培养基购自中国瑞博公司；Lipofectamine 2000 Transfection Reagent购自美国Invitrogen公司；MTS细胞活力检测试剂盒购自美国Promega公司；β-actin抗体购自北京天德悦公司；MICU1抗体，羊抗兔二抗购自美国Abcam公司；BCA蛋白定量试剂盒购自中国Beyotime公司；EdU试剂盒购自广州锐博生物科技有限公司；免疫组织化学SP染色试剂盒购自Invitrogen公司。

1.3 免疫组织化学法检测MICU1在RCCC组织的表达

将RCCC病理切片置于烤箱中，68℃处理20 min，常规脱蜡，采用柠檬酸高压修复抗原，PBS冲洗，山羊血清37℃封闭20 min，滴加MICU1（1∶1 000稀释）一抗孵育2.5 h，PBS冲洗3次；DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片显微镜下阅片。根据阳性细胞所占比例及阳性细胞染色强度计算染色实验结果。阳性细胞所占比例＜10%计0分，11%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，＞75%计4分。阳性细胞染色强度：阴性染色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分，褐色计4分。结果 由2位病理技术人员在每张切片中随机计数5个高倍视野（×200）进行分析。

1.4 基于TCGA数据库分析MICU1 mRNA在RCCC中的表达及其与临床病理特征和预后的关系

利用TCGA（https：//cancergenome.nih.gov/）搜索并下载RCCC表达谱数据，排除缺失临床参数和生存资料患者，最终获得517例RCCC组织的RNAseq数据及对应的患者临床数据。按照中位数法将RCCC样本分为高表达组（RCCC表达水平≥17.6）和低表达组（RCCC表达水平＜17.6），分析其与临床病理特征及预后的关系。采用Kaplan-Meier Plotter（http：//kmplot.com/analysis）分析MICU1 mRNA表达与RCCC患者预后的关系。

1.5 细胞培养和转染

CAKI-1细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5%CO2孵箱条件下培养。按每孔约5×105个细胞铺种于6孔板，恒温培养24 h，细胞密度至80%左右转染，转染试剂采用LipofectamineTM2000。采用瞬时转染法分别将MICU1干涉片段和MICU1过表达质粒转染到CAKI-1细胞中，标记为siMICU1组和MICU1组；同时设置相应的阴性对照，标记为siCtrl组和EV组。

1.6 Western blot法检测MICU1蛋白的表达

收集对数生长期的CAKI-1细胞，PBS洗涤2次，加入RIPA裂解液，冰上孵育20 min，在4℃下12 000 r/min离心30 min，取上清液。采用BCA蛋白定量试剂盒测定MICU1蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液，100℃煮沸10 min。按每孔55μg上样，SDS-PAGE电泳后将蛋白转移至PVDF膜，在5%脱脂奶粉中室温封闭1 h，加入一抗MICU1抗体（1∶1 000）和β-actin抗体（1∶2 000），4℃孵育过夜；加羊抗兔二抗（1∶10 000），室温孵育1 h，TBST洗膜3次，用ECL显影。采用ImageJ软件对Western blot条带进行灰度分析，蛋白表达量=目的蛋白的灰度值/内参蛋白的灰度值。实验重复3次。

1.7 MTS法检测CAKI-1细胞的生长情况

取对数生长期的CAKI-1细胞，以2×103/孔细胞密度加入96孔板，于5% CO2、37℃下孵育24 h；显微镜观察，每孔加入20μL MTS溶液（5 mg/mL），继续培养2 h。采用酶联免疫检测仪于490 nm波长处检测各孔的吸光度（OD）值，记录数据记为0 d，同样方法分别于1 d、2 d、3 d、4 d检测剩余4板样品孔OD值并记录，绘制细胞生长曲线。实验重复3次。

1.8 EdU实验检测CAKI-1细胞的增殖能力

取对数生长期细胞，以4×104/孔接种于24孔板中，在细胞培养箱中培养过夜。用细胞培养液1∶1 000稀释EdU A液至50μmol/L，每孔加入500μL稀释后的溶液，37℃孵育2 h，PBS清洗细胞2次，加500μL 4%的多聚甲醛溶液固定25 min，PBS洗涤2次；加入500μL 2 mg/mL甘氨酸孵育5 min，PBS洗涤2次；加入500μL 0.5% TritonX-100的PBS，脱色摇床孵育10 min，PBS洗涤2次；加入提前配置好的EdU工作液500μL避光孵育30 min，加入渗透剂后分别用甲醇和PBS洗涤；加1×Hoechst33342反应液染细胞核，荧光显微镜拍照计数。实验重复3次。

1.9 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。采用配对t检验比较RCCC组织及其癌旁正常组织中MICU1蛋白表达水平的差异；采用χ2检验分析MICU1蛋白表达水平与各临床病理参数间的关系；采用Kaplan-Meier以及Log-rank检验进行生存分析；采用Cox回归分析MICU1表达水平与RCCC患者预后的关系。以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MICU1蛋白在RCCC组织中的表达

免疫组织化学法检验结果显示，MICU1表达于细胞浆，且RCCC组织中MICU1的阳性表达评分低于癌旁正常组织［（4.4±0.8）分vs（11.8±1.0）分，t=5.856，P＜0.001）］，见图1。

图1 MICU1蛋白在RCCC组织中的表达Fig.1 Expression of MICU1 protein in RCCC tissues

2.2 基于TCGA数据库分析MICU1 mRNA表达与RCCC患者临床病理特征的关系

TCGA数据库分析结果显示，MICU1表达与性别、TNM分期有关（P＜0.05），但与年龄无关（P＞0.05），见表1。

2.3 基于TCGA数据库分析MICU1表达与RCCC患者生存的关系

TCGA数据库分析结果显示，MICU1高表达患者未达到中位死亡人数，MICU1低表达组中位生存期为71.3个月（95%CI：62.8～79.6个月），两组生存曲线比较差异有统计学意义（χ2=19.290，P＜0.001），见图2。

图2 MICU1表达与RCCC患者总生存期的关系Fig.2 Relationship between expression of MICU1 and overall survival in RCCC patients

2.4 基于TCGA数据库分析影响RCCC患者预后的因素

单因素Cox回归分析，年龄、TNM分期、MICU1表达可能与RCCC患者预后有关（P＜0.05）；多因素Cox回归分析结果，MICU1低表达是影响RCCC患者总生存的独立危险因素（HR=1.641，95%CI：1.191～2.261，P=0.002）。见表2。

2.5 构建MICU1干涉和过表达细胞株

Western blot检测结果显示，siMICU1组MICU1蛋白表达水平低于siCtrl组（t=5.985，P=0.004），见图3A；MICU1组MICU1蛋白表达水平高于EV组（t=3.482，P=0.025），见图3B。说明过表达和干涉的MICU1细胞均构建成功，可用于后续MICU1细胞生物学功能研究。

表1 MICU1表达与RCCC患者临床病理特征的关系Tab.1 Relationship between expression of MICU1 and clinicopathological features in RCCC patients

2.6 干涉和过表达MICU1对RCCC细胞生长的影响

MTS实验结果显示，siCtrl组和siMICU1组转染第4天对应的OD值分别为0.746±0.021和1.267±0.027，差异有统计学意义（t=15.110，P=0.001），见图4A；EV组和MICU1组转染第4天对应的OD值分别为0.903±0.038和0.620±0.034，差异有统计学意义（t=5.587，P=0.005），见图4B。

表2 影响RCCC患者总生存期的单因素和多因素分析Tab.2 Univariate and multivariate analysis of overall survival in patients with RCCC

图3 Western blot检测CAKI-1细胞中MICU1蛋白的表达Fig.3 Expression of MICU1 protein in CAKI-1 cells detected by Western blot

图4 MTS实验检测干涉和过表达MICU1对RCCC细胞生长的影响Fig.4 Effects of inter ference and overexpression of MICU1 on the proliferation of RCCC cells detected by MTS assay

2.7 干涉和过表达MICU1对RCCC细胞增殖的影响

EdU实验结果显示，siMICU1组和siCtrl组的细胞增殖率分别为（0.436±0.014）%和（0.288±0.019）%，差异有统计学意义（t=6.307，P=0.003），见图5A；MICU1组和EV组的细胞增殖率分别为（0.231±0.007）%和（0.319±0.021）%，差异有统计学意义（t=4.014，P=0.016），见图5B。

图5 EdU实验检测干涉和过表达MICU1对RCCC细胞增殖的影响Fig.5 Effects of interference and overexpression of MICU1 on the proliferation of RCCC cells detected by EdU assay

3 讨论

基因治疗是目前肿瘤治疗领域的研究热点，是一种新的治疗理念，其通过对某些肿瘤基因进行特殊处理，再导入细胞，从而抑制癌细胞的发生与发展，发挥靶向治疗的作用［9］。迄今为止，关于线粒体钙摄取蛋白的基因功能、蛋白表达及生理特性等方面的研究较多，研究表明MICU1在不同肿瘤中表达不同。MARCHI等［7］在人类结肠癌肿瘤组织中发现MICU1的表达水平较癌旁正常组织低。WANG等［10］研究亦发现MICU1在肝癌组织中呈低表达。本研究亦发现MICU1在RCCC组织中表达水平降低。然而，CURRY等［11］却发现雌激素受体阴性基底样乳腺癌中MICU1表达上调，这可能与不同肿瘤组织来源不同有关。另外，多项研究表明，MICU1表达与患者预后相关，如在乳腺癌中MICU1低表达与患者不良预后相关［12］，而在卵巢癌中MICU1高表达与患者较低整体存活率有关［5］。本研究通过分析517例RCCC患者癌组织中MICU1表达与患者生存的关系，发现MICU1低表达患者的中位生存期低于高表达患者，与MICU1在乳腺癌作用一致，低表达的RCCC患者预后较差。

本研究还进一步在RCCC细胞中干涉MICU1表达，发现RCCC细胞生长和增殖能力显著增强，反之过表达MICU1后，细胞生长和增殖能力显著受抑制。然而，目前就MICU1促进RCCC细胞增殖的机制尚未阐释。有研究证实MICU1是MCU的负向调节因子［13］，在结直肠癌中MCU表达升高可促进肿瘤发生发展，其机制是线粒体钙水平的增加及促进肿瘤细胞能量代谢［14］。而金明朋等［15］也发现钠钙交换体NCLX表达降低可导致线粒体钙水平升高，进而促进肝癌细胞增殖和抑制凋亡。另有学者［16］报道MICU1的表达缺失可诱导线粒体钙超载，进而促进肿瘤进展，并产生化疗药物抗性。MARCHI等［7］研究发现在HeLa细胞中干涉MICU1可促进细胞增殖，而过表达MCIU1抑制细胞增殖，其中也伴随着HeLa细胞中线粒体钙水平的升高。由此可见，MICU1表达下降导致的线粒体钙水平升高可能是MICU1低表达促进RCCC细胞增殖的机制之一。此外，MICU1表达下降还可促进肿瘤细胞的糖酵解过程［5］以及ROS生成增加［16］，进而促进卵巢癌的进展，这些也可能是MICU1促进RCCC细胞增殖的原因。

综上所述，本研究发现MICU1在RCCC组织中呈低表达，MICU1低表达是影响RCCC患者总生存期的独立危险因素，MICU1低表达可促进RCCC细胞增殖能力。但由于本研究样本量及临床特征数据收集有限，故上述结论仍需扩大样本量进一步验证，目前MICU1促进RCCC细胞生长和增殖的分子机制亦有待阐明。