WGA、RDB结合STR单体型分析在β-地中海贫血胚胎植入前遗传学诊断中的应用

李伍高 严提珍 李哲涛 唐永梅 秦祖兴 李忻琳 蔡稔★

β-地中海贫血（β-thalassemia，简称“β-地贫”），是一组全球最常见、对人类健康影响最大的常染色体单基因隐性遗传病之一。在中国，多发于南部沿海地区，其中以广西、海南、广东常见，分子流行性病学调查结果显示广西β-地贫致病基因携带率为6.43%［1］。β-地贫分为点突变型和缺失型，以点突变型最为常见。

目前预防和控制地贫的诊断方法包括传统产前诊断和植入前遗传学诊断（Preimplantation Genetic diagnosis，PGD）。前者是在不同孕周进行绒毛膜取绒毛或羊膜腔穿刺抽取羊水或脐带血等方法对已孕胚胎进行基因诊断，而PGD 是将常规产前诊断提早到胚胎于子宫着床之前进行活检和遗传学分析，选择无遗传性疾病的胚胎植入子宫腔内，从而获得正常胎儿的诊断方法。目前应用于β-地贫PGD 的方法包括：巢式PCR 结合变性梯度凝胶电泳（denaturing gel gradient electrophoresis，DGGE）分析技术［2］、应用引物延伸预扩增方法［3］、全基因组扩增技术（whole genome amplification，WGA）［4］、单细胞巢式PCR 技术［5-7，16］、Taq-Man-MGB 探针实时荧光PCR 技术［8］、突变扩增系统（amplification refractory mutation system，ARMS）技术［9］、荧光共振能量转移杂交探针实时PCR 技术［10］、多重置换扩增（multiple displacement amplification，MDA）结合巢式PCR 技术［11］、短串联重复（short tandem repeat，STR）序列单体型分析技术［12-13］、荧光PCR 、技术［14-15］。希腊［2］、印度［9］、台湾［10］、新加坡［12］、伊朗［13-15］、意大利［16］、中国［3-8，11］都有β-地贫PGD 的成功案例。近几年国内学者利用胚胎培养基成功进行β-地贫IVS-II 654 突变的无创植入前胚胎遗传学检测［17］。本研究分析2017年1月至2018年12月在本院进行β-地贫PGD 的周期资料，探讨WGA 结合致病位点检测和STR 序列单体型分析进行β-地贫PGD 的效果。

1 材料和方法

1.1 研究对象

分析本中心2017年1月至2018年12月进行β-地中海贫血PGD 的检测资料，纳入研究71 个检测周期合计501 个胚胎，该项目通过柳州市妇幼保健院生殖医学伦理委员会批准（20170221029），且每对夫妇均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 STR 位点的鉴定和选择

利用UniSTS 和UCSC 数据库选择15 个与β-珠蛋白基因紧密关联的STR 标记（HBB4506、D11S988、HBB4677、D11S2362、HBB5089、D11S1243、HBB5138、HBB5178、HBB5205、D11S1760、HBB5576、HBB5655、HBB5820、HBB5859、D11S1338）。为提高诊断的准确性和减少人工stutter 峰的干扰，所有选择的STR 位点均为三核苷酸或四核苷酸重复，用Oligo7.56 软件设计STR 序列引物，由生工生物（上海）股份有限公司合成。随后，对260 例无血缘关系的健康个体进行基因分型，以评估每个STR 位点的基因型频率。

1.2.2 囊胚滋养外胚层活检

采取常规排卵方案促排卵，行ICSI 授精，授精后16～18 小时观察受精情况，取卵后对第5 天囊胚评分为3BB 以上、第6 天囊胚评分为4CB/4BC 以上的胚胎采用激光法打孔，活检4～10 个滋养层细胞。

1.2.3 全基因组扩增

全基因组扩增试剂盒采用德国QIAGEN 公司的REPLI-g Single Cell Kit。将活检出的细胞移入PBS 中洗涤3 次，装入3.5 μL PBS 缓冲液200 μL PCR 管中，同时取最后一次洗涤的PBS 2 μL 转入阴性对照管中；加入3.5 μL D2 试剂65℃裂解10 min，冰盒保存加入3.5 μL 终止液，瞬时离心；加入9 μL 超纯水，29 μL REPLI-g 反应缓冲液，Polymerase 2 μL，上PCR 仪30℃8 h，95℃5 min，4℃保存，取1.0 μL 产物稀释100 倍使用。

1.2.4 STR 位点检测

分为单管15 重，引物100 pmol/μL 等体积混合 备 用，10×PCR Buffer 5.0 μL，2.5 mmol/μL dNTPs 2.5 μL，DMSO 5.0 μL，Hot star Taq（TAKARA，大连）0.5 μL，混合引物4.0 μL，模板2.0 μL，ddH2O 33 μL。95℃预变性5 min；95℃变性30 s，54℃退火45 s，72℃延伸60 s，共35 个循环；72℃后延伸30 min，12℃保存。

1.2.5 毛细管电泳

利用美国ABI3500Dx 遗传分析仪进行毛细管电泳，体系：Genescan 500LIZ Size standard（0.5+9.0）μL HI-DI 甲酰胺+1.0 μL PCR 产物；95℃变性5 min，迅速冰浴冷却5 min。

1.2.6 致病位点检测

常见位点使用β-地中海贫血基因检测试剂盒（深圳益生堂）进行反向点杂交（reverse dot blot，RDB）检测，按说明书操作，罕见位点利用Sanger 测序检测，外送上海立菲生物技术有限公司。

1.2.7 胚胎移植均为单囊胚移植，专人负责随访。

2 结果

2.1 15 个STR 位点的杂合度情况

根据各STR 位点观察到的等位基因数及等位基因频率，发现D11S1243 杂合度最高，为0.90；最低为HBB5178，为0.62，15 个STR 位点杂合度高，适合应用于β-地中海贫血胚胎植入前遗传学检测的单体型构建。见表1。

表1 15 个STR 位点的杂合度Table 1 Heterozygosity of 15 STR loci

2.2 β-地贫PGD 的结果

71 个周期501 枚囊胚基因检测结果及部分家系STR单倍型分析结果。中69 对夫妻进行了移植，移植周期92 个，生化妊娠率63.04%，临床妊娠率53.26%，合计45 对夫妇进行了产前诊断或流产物分析，与胚胎检测结果一致性为100%。见表2，图1。

Ⅰ-1（父亲）β-28突变携带者，Ⅰ-2（母亲）为β41-42突变携带者，有6 个囊胚，其中Ⅱ-1（胚胎1）为未携带突变的正常胚胎，Ⅱ-2（胚胎2）和Ⅱ-5（胚胎5）的STR 结果分别提示可能为单体和三体，Ⅱ-3（胚胎3）为β41-42突变携带者，Ⅱ-4（胚胎4）和Ⅱ-6（胚胎6）为β-28/β41-42复合杂合突变地贫胚胎。

表2 71 个周期501 枚囊胚基因检测结果Table 2 The results of 501 blastocyst gene test in 71 cycles

图1 部分家系STR单倍型分析结果Figure 1 STR haplotypes analysis in some families

3 讨论

随着分子生物学技术飞速发展，越来越多的检测技术应用到胚胎植入前遗传学诊断。但是不可避免出现单细胞PCR 产物少、扩增失败、等位基因脱扣（allele drop out，ADO）等问题，故欧洲人类生殖与胚胎学学会（European Society of Human Reproduction and Embryology，ESHRE）推荐DNA 扩增引物设计中除了致病基因之外，还应包括相邻的相关及不相关位点，通过高度多态性标志物的分析，可以判断外源性DNA 污染及ADO，从而提高单基因病PGD 准确率［18］。WGA 结合PCR 及其衍生的PCR 技术、STR 位点单体型构建成本低廉，可给需要进行PGD 治疗的患者降低经济负担，而且误诊率低、检测成功率高，能满足日常的临床检测需求，故应用广泛。

目前WGA 技术主要有四种：简并寡核苷酸引物PCR 扩增（Degenerate oligonucleotide primer-PCR，DOP-PCR）、多重置换扩增（MDA）、置换预扩增和PCR 扩增的组合（multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC）和转座子插入线性扩增（Linear Amplification with Transposon Insertion，LIANTI）［19-20］。WGA 技术通过非选择性地扩增活检的滋养外胚层细胞的整个基因组DNA，在真实反映基因组全貌的基础上最大限度地增加其DNA 量，为后续分析提供足量的DNA模板［19］，在单体型构建方面，我们应用的是短串联重复序列，目前应用于β-地贫胚胎植入前遗传学检测的STR 位点较少［13，15］，而且由于杂合度问题，选择的STR 位点不是每个点都能应用到单体型构建来分析胚胎检测结果。这就使得实际上每对进行PGD 的夫妇所用得到的STR 位点更加少，造成胚胎检测结果不明确风险增加，更多的时候需要增加STR 位点来进行检测［12］，本研究选择的15 个STR 位点杂合度均超过0.5，能满足单体型构建。

β-地贫是常见的常染色体隐形遗传病，符合经典的孟德尔遗传规律，正常：携带：重型比例约为1∶2∶1。在本研究结果中，正常比例21.35%（101/473），携带者比例49.05%（232/473），重型β-地贫比例23.89%（113/473），约为1∶2∶1，符合孟德尔遗传规律，可间接的证明该检测技术的安全性。

在进行胚胎移植过程中，笔者优先选择移植正常胚胎，携带者胚胎次之，如无胚胎可移植的情况下选择致病位点检测为正常或携带者而STR 提示重组的胚胎；重型β-地贫和STR 提示11 号染色体发生拷贝数变异的胚胎不考虑移植，均进行单囊胚移植。

通过检测结果较符合孟德尔遗传规律，而且产前诊断符合率高，虽然越来越多的技术应用到β-地贫植入前遗传学诊断，但是利用全基因组扩增结合STR单体型分析和致病位点进行β-地贫胚胎植入前遗传诊断仍不失为一种不错的选择。