甲基化荧光定量PCR快速检测自闭症男童中脆性X综合征的临床应用

陈剑虹 黄淑君 马健 周伟平 张亮★

脆性X综合征是造成智力低下和自闭症谱系障碍的主要单基因病因［1-2］，这种X 连锁综合征主要是由于脆性X 智力低下基因1（fragile X mental retardation 1，FMR1）基因5′非编码区的（CGG）n 异常扩增导致的。

常用的分子遗传学检测方法有基于DNA 水平的Southern blot 法［3］和PCR 法。Southern blot 作为诊断脆性X 的金标准，但是该方法费时费力，需要DNA 量大，不适合临床常规使用。基于DNA的PCR 方法简单快速，包括检测FMR1基因5′非编码区CGG 重复数和启动子区甲基化状态两种，临床应用最多的是检测CGG 重复数的侧翼PCR（flanking PCR，F-PCR）［4-5］。F-PCR 法针对FMR1基因所在位置的CGG 富集区进行PCR 扩增，采用毛细管电泳的方法进行判读。F-PCR 法由于大片段重复不易扩增，只能检测一定的CGG 重复数，超出范围的病例易造成漏检。已有研究发现当CGG 重复数达到全突变水平，会同时伴随FMR1启动子区CpG 岛的异常甲基化［6］。而有文献报道CGG 重复达到全突变的男性当CpG 岛不发生甲基化，并无明显临床症状的案例［7-8］。说明甲基化是引起FMR1基因功能失活、造成脆性X 智力低下蛋白（fragile X mental retardation protein，FMRP）缺失引发脆性X综合征更重要的原因。已有一些研究针对检测FMR1启动子区CpG 岛的甲基化情况［9］，但由于操作繁琐临床上尚未得到广泛应用。本研究建立了一种新的TaqMan 探针甲基化实时荧光定量PCR 法（quantitative methylation-specific PCR，qMSP），并在自闭症男童中检测外周血FMR1基因启动子区域甲基化状态，建立一种快速准确检测脆性X综合征的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

选取2017年1月至2018年4月在广东省妇幼保健院经过F-PCR 确诊为脆性X综合征男童3例，年龄范围：3～6 岁，中位数在4 岁2 个月，正常男童20 例、女童3 例，年龄范围：3～9 岁，中位数在5 岁3 个月，外周血DNA 保存于-20℃冰箱。测试组：2018年4月收集惠州市护苗培智学校中自闭症男童54 名，年龄范围：3～8 岁，中位数在4 岁5 个月外周血2mL，保存于EDTA 抗凝管中。已知组和测试组2 组人群年龄差异无统计学意义（P=0.56），年龄不会对结果产生影响，因此进行下一步实验。

所有受试者均签署知情同意。入组的自闭症患儿均满足美国精神疾病协会2010年2月发布的《精神疾病诊断与统计手册》第五版对儿童自闭症谱系障碍诊断标准［10］。本研究已经惠州市妇幼保健计划生育服务中心伦理委员会审核通过。

1.2 方法

1.2.1 试剂/仪器

引物探针均合成于上海百力格生物技术有限公司，DNA 亚硫酸盐处理试剂盒（磁珠法）购自上海敬善生物科技有限公司。亚硫酸盐转化后的DNA 所使用的PCR 扩增体系2×GoldStar TaqMan Mixture购自北京康为世纪生物科技有限公司。荧光定量PCR 仪器为ABI 7500 Fast Real-Time PCR System。FMR1基因甲基化阳性样本和其母亲血样由苏州珀金埃尔默医学检验所用F-PCR 其检测CGG 重复数。

1.2.2 血液DNA 提取

采用广州赛哲生物科技有限公司的磁珠试剂盒提取54 例自闭症男童全血DNA，用紫外分光光度计测量DNA 纯度和浓度，DNA 样本置-20℃保存。

1.2.3 甲基化实时荧光定量PCR（quantitative methylation-specific PCR，qMSP）

在经过亚硫酸盐处理后，发生了甲基化的CpG 岛保持CG 序列，而没有发生甲基化的CpG岛则转化为UG 序列。本研究设计的FMR1基因的引物、探针是针对亚硫酸盐处理后仍然保持CG序列的原理进行设计。上游引物FMR1-F：5′-TGATTTTTTACGTTATTGAGT-3′ ，下 游 引 物FMR1-R：5′-GAATCGAAAAACAAACGC-3′，探针FMR1-P：5′-CACTACCTCGCGAAAACCAA-3′（5′-FAM，3′-MGB 修饰）。内参ACTB基因引物探针设 计：ACTB-F：5′-TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT-3′ ACTB-R：5′-AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3′，ACTB-P：5′-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3′（5′-HEX，3′-BHQ1 修饰）。扩增条件93℃10 min；然后56℃1 min、65℃30 s（收集荧光）、94℃30 s，50 个循环；40℃10 s。

1.2.4 统计学方法

本研究采用t检验对纳入的两组数据进行对比检验，差异大小采用P值判断。P＞0.05 表示两组数据之间差异无统计学意义，P＜0.05 表示两组数据之间差异有统计学意义。

2 结果

2.1 已知基因型样本的qMSP 检测结果

在正常男性的DNA 样本中，内参基因ACTB阳性（Ct 值26.73～28.93），FMR1基因甲基化阴性。脆性X综合征男性患者内参基因ACTB阳性（Ct 值26.95～27.98），FMR1基因阳性（Ct 值27.11～29.57），平均△Ct=1.18。正常女性内参基因ACTB阳性（Ct 值27.23～29.85），FMR1基因阳性（Ct 值29.68～32.64），平均△Ct=2.64（见图1）。

图1 已知脆性X 患者FMR1 甲基化类型的qMSP 结果Figure 1 qMSP results of samples with known methylation status

2.2 特殊学校男童qMSP 检测结果

鉴于本研究建立起来的体系在测试已知样本时稳定可靠，对惠州市护苗培智学校54 名3～8 岁自闭症男童行本研究qMSP 检测，有1 例检测到FMR1阳性信号（Ct 值30.69）（见图2），检出率为1.85%。

图2 检出一例甲基化阳性男性患儿的qMSP 结果Figure 2 qMSP result from a boy detected positive FMR1 methylation

2.3 qMSP 阳性结果F-PCR 复核结果

为了确认qMSP 检出FMR1基因甲基化阳性的男童的CGG 具体重复次数，以及其母亲是否为CGG 的前突变，经过苏州珀金埃尔默医学检验所F-PCR 检测，确认该男童的CGG 重复数为383，为全突变。可确诊其自闭症的真实原因为脆性X综合征。其母亲无临床症状，F-PCR 检测CGG 拷贝数为30 和81，为前突变携带者。F-PCR 结果参见图3 和图4。

图4 qMSP 阳性男童母亲的F-PCR 方法判读的CGG 重复次数图为30 和81Figure 4 F-PCR result of the positive boy's mother with 30 CGG copies and 81 copies

3 讨论

脆性X综合征是由于FMR1基因5′非编码区CGG 重复数过度扩增，当大于200 拷贝时，引起FMR1基因启动子区域高度甲基化导致基因沉默，其编码的蛋白FMRP 表达减少，造成智力低下或性格孤僻等一系列临床症状［11］。以此为基础，出现了多种检测方法，临床最常用的是检测CGG 重复数的F-PCR 法诊断脆性X综合征，但该方法有扩增CGG 重复次数上限［12］。我院也根据文献建立了F-PCR 方法，发现CGG 重复片段较多时，就难以扩增成功。故本研究把qMSP 检测为阳性的男童及其母亲血液DNA 样本外送苏州珀金埃尔默医学检验所进行复核确认。另外，由于有发现CGG 重复次数为全突变却不发生甲基化，并且没有临床症状的案例的报道［7-8］，使得人们更加清晰地认识到甲基化导致的基因沉默才是导致脆性X综合征的根本原因，致使越来越多的关注投放到甲基化的检测上。

国内已报道的通过PCR 检测FMR1基因甲基化状态的方法有：甲基化敏感性限制性内切酶定量PCR（methylation-sensitive restriction enzymesbased quantitative PCR，MSRE-qPCR）［13］、甲基化特异性多重连接探针扩增（methylation specific multiplex ligation-dependent probe amplification，MSMLPA）［14］。限制性内切酶只能识别一种酶切位点，对于其它形式的甲基化CG 不能切割，易造成偏差，且存在消化不完全的问题，操作繁琐，不适合临床应用。而MS-MLPA 需要设计多对探针后续还要进行毛细管电泳，操作烦琐价格昂贵，不适合大规模检测。2009年美国艾莫利大学采用与本研究相似的qMSP 法筛查3 万多名新生男婴的FMR1甲基化情况［15］，操作简单、快速、准确，且费用低。国内迄今还未见qMSP 应用于临床检测脆性X综合征的报道。qMSP 的核心也是难点在于，亚硫酸盐处理后的DNA 的GC 含量严重下降，在这样的DNA 模板上需要设计合适的引物探针来检测CpG 序列的存在并保持qPCR 反应的高效性和特异性。本研究克服了这一难题，建立一种qMSP 方法，可以为临床检测脆性X综合征临床提供一种新的选择。

本方法首先在已知样本中确认FMR1启动子区CpG 岛甲基化状态，结果显示正常男性FMR1是非甲基化的，正常女性和脆性X综合征男性患者FMR1是甲基化的，与实际一致，说明本方法稳定可靠。2015年，国内首都儿科研究所采用毛细管电泳检测CGG 重复数的方式筛查540 例智力低下男童检出5 例脆性X 阳性，检出率0.93%［17］，可能与仅采用F-PCR 毛细管电泳检测CGG 重复数诊断脆性X综合征造成的漏检有关。本研究的检出率高于2015年首都儿研所的研究，可能甲基化检测更为准确，但低于参考发病率，可能与本文入组的样本只为自闭症有关。

基于一般的三甲医院都已经有荧光定量PCR仪，因此qMSP 是一项快速筛查自闭症或者智力低下男童是否为脆性X综合征的较理想方案。但由于正常女性的一条染色体存在自然失活的状态，其上的FMR1基因也发生了甲基化，因此qMSP 其不能用于在女性中检测FMR1的前突变和全突变。