血管内皮生长因子基因936C/T位点多态性与急性心肌梗死的关系

常亚伟 李赛 琚绍坦

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是临床常见的心血管系统疾病，病情较重，具有较高的致残率和致死率。近年来，我国AMI的发病率不断升高且发病人群呈年轻化趋势，已经成为威胁国民健康的公共卫生问题。血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是具有强大促血管新生作用的细胞因子，在AMI、脑梗死等缺血性疾病的发病过程中，能够促进新生血管形成、增加血管通透性，有利于改善缺血组织的血流灌注［1］；多项动物实验也证实VEGF 能够减轻AMI 大鼠的心肌损伤［2-4］。人的VEGF基因位于染色体6q21，位于3′非编码区的rs3025039 位点（936C/T）是常见的基因多态性位点，发生胞嘧啶（C）向胸腺嘧啶（T）的突变已经被证实与脑梗死的发生有关［5］，但VEGF基因936C/T 多态性在AMI 中的作用尚未完全阐明。因此，本研究旨在探讨VEGF基因936C/T 多态性与AMI 的关系，以期从基因角度阐明AMI 发病的易感因素、为筛查AMI 高危人群提供新思路。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2016年7月至2018年12月在本院且首次诊断为AMI 的120 例患者作为AMI 组，入组标准：①符合中华医学会心血管病学分会指定的《急性心肌梗死诊断和治疗指南》［6］中的判断标准；②临床资料及临床样本完整。排除标准：①肝肾功能不全；②合并恶性肿瘤、自身免疫性疾病、血液疾病；③既往有心肌梗死、脑梗死病史。另取同期在本院进行健康体检的150 例志愿者作为对照组。本研究的方案获伦理委员会审批同意，所有入组对象均签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂

全血基因组DNA 提取试剂盒、PCR 酶预混液购自美国赛默飞公司。VEGF基因936C/T 位点的引物由上海生工公司合成，序列如下：上游5′-CTGAAATGAAGGAAGAGGAGAC-3′ 、下 游5′ -TCCCCTCCCAACTCAAGTCCAC-3′；美国BIORAD 伯乐T100 型梯度PCR 仪为艾本德公司，德国耶拿UVP Gelstudio touch 凝胶成像仪为南京世研仪器公司。

1.3 方法

1.3.1VEGF（936C/T）基因多态性的检测

取AMI 组和对照组的肘静脉血2 mL（EDTA抗凝），用全血基因组DNA 提取试剂盒提取基因组DNA，采用PCR 酶预混液、配置PCR 反应体系，具体如下：基因组DNA 2 μL、PCR 酶预混液10 μL、10 pmol/L 的上下游引物各0.4 μL、去离子水7.2 μL，按下列程序进行PCR 反应：95℃预变性10 min，而后95℃变性40 s、54℃退火40 s、72℃延伸40 s，重复40 个循环后72℃继续延伸50 s、得到PCR 产物。PCR 产物用限制性内切酶进行酶切反应，酶切反应体系为PCR 产物1 μL，限制性内切酶10 U，去离子水补足至10 μL，37℃水浴过夜，次日酶切产物进行2%琼脂糖凝胶电泳100 V，60 min，琼脂糖凝胶在凝胶成像仪中显影得到酶切产物的图像，根据图像判断VEGF基因936C/T 位点的多态性：364 bp 一个片段为CC 基因型、249 bp、115 bp 两个片段为TT 基因型、364 bp、249 bp、115 bp 3个片段为CT基因型，如图1。

1.3.2 观察指标

两组受试者的性别、年龄、吸烟史、饮酒史、高血压史、糖尿病史、高脂血症史、总胆固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglycerides，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（Low density lipoprotein cholesterin，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）、磷酸肌酸激酶同工酶（Creatine Kinase Isoenzyme-MB，CK-MB）、心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin，cTnI）。

图1 琼脂糖凝胶电泳图Figure 1 Agarose gel electrophoresis

1.4 统计学处理

用SPSS 21.0 软件进行统计学分析。计量资料以（）表示，两组间均数的比较采用独立样本t检验或非参数秩和检验，计数资料以n（%）表示。采用χ2检验。采用二分类Logistic 回归分析危险因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般临床资料资料比较

AMI 组的年龄、吸烟率、高血压率、糖尿病率、高脂血症率、高Hcy 血症率及血清TC、LDL-C、VEGF 水平均明显高于对照组，血清HDL-C 水平明显低于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。性别、饮酒率、TG 水平比较两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 两组基线资料比较［n（%）］Table 1 comparison of basic clinical characteristics between 2 groups［n（%）］

2.2 两组VEGF 基因型及等位基因频率分布比较

两组间VEGF基因936C/T 位点基因型及等位基因频率的分布，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 两组VEGF 基因型及等位基因频率的比较 ［n（%）］Table 2 Comparison of VEGF genotype and allele frequency between two groups［n（%）］

2.3 AMI 组中不同VEGF 基因型患者血清指标的比较

AMI 组中VEGF基因936C/T 位点CT+TT 基因型患者的血清CK-MB 峰值、cTnI 峰值明显高于CC 基因型患者，血清VEGF 水平明显低于CC 基因型患者，差异具有统计学意义（P＜0.05）。CC 基因型与CT+TT 基因型患者血清TG、TC、LDL-C、HDL-C、Hcy 水平比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 AMI 组中不同VEGF 基因型患者血清指标的比较［n，（±s）］Table 3 Comparison of serum indexes between patients with different VEGF genotype in AMI group［n，（±s）］

表3 AMI 组中不同VEGF 基因型患者血清指标的比较［n，（±s）］Table 3 Comparison of serum indexes between patients with different VEGF genotype in AMI group［n，（±s）］

项目TG（mmol/L）TC（mmol/L）LDL-C（mmol/L）HDL-C（mmol/L）Hcy（mmol/L）BG（mmol/L）VEGF（ng/mL）CK-MB 峰值（U/L）cTnI 峰值（ng/mL）CT+TT 基因型（n=79）1.90±0.45 4.93±0.96 3.08±0.77 1.01±0.23 12.94±2.85 6.77±0.94 89.12±14.58 429.69±83.94 4.67±1.33 CC 基因型（n=41）1.84±0.39 5.16±0.89 2.93±0.70 1.09±0.20 13.09±3.44 6.44±1.04 125.24±19.22 338.14±67.62 4.11±1.19 t 值0.724 1.275 1.043 1.887 0.254 1.758 11.512 6.037 2.265 P 值0.471 0.247 0.299 0.062 0.800 0.081 0.000 0.000 0.025

2.4 AMI 相关危险因素的Logistic 回归分析

采用逐步回归方法筛选危险因素，分析结果显示：年龄、吸烟、高血压、糖尿病、高脂血症、VEGF基因CT+TT 基因型是AMI 发生的独立危险因素。其中，与VEGF基因CC 基因型比较，CT+TT 基因型患者发生AMI 的风险增加见表4。

表4 AMI 相关危险因素的Logistic 回归分析Table 4 Logistic regression analysis of related risk factor for AMI

3 讨论

VEGF 是直接作用于血管内皮细胞的促有丝分裂因子，能够促进新生血管形成、增加血管通透性。在心肌梗死、脑梗死等缺血性疾病中，VEGF通过其促血管新生及增加血管通透性的作用能够增加缺血病灶的侧枝循环及血流灌注，进而减轻局部组织的缺血缺氧损伤。多项临床研究报道，心肌梗死及脑梗死患者血清中VEGF 的含量增多［7-9］；本研究对AMI 患者血清VEGF 的分析与已有的报道一致，即AMI 组血清VEGF 含量明显增多，分析认为VEGF 的增多可能是机体在缺血缺氧状态下自我保护及自身代偿的机制。另有研究报道，AMI 预后不良患者的血清VEGF 含量低于预后良好患者［10］，由此更加印证了VEGF 增多是AMI 发生后的一种自我保护及自身代偿，预后不良患者VEGF 含量较低提示自我保护及自身代偿不足，VEGF 介导的促进新生血管形成、增加血管通透性作用较弱，因而远期预后较差。

VEGF 分泌的调控机制复杂，缺血缺氧、炎症及氧化应激等刺激会增加VEGF 的表达和分泌［11-13］，编码VEGF 的基因本身存在多态性也会影响VEGF 的表达和分泌。目前已知VEGF基因多态性的位点超过30 个，其中研究较为成熟的多态性位点是3′非翻译区上的936C/T 位点，该位点C向T 突变增多已经被证实与急性脑梗死的发生有关［14-15］。本研究对AMI 患者VEGF基因936C/T 多态性的分析显示：AMI 组VEGF基因936C/T 位点CT+TT 基因型的比例及等位基因T 的频率明显增加，说明VEGF基因936C/T 位点C 向T 突变的增多与AMI 的发生有关。936C/T 位点位于VEGF基因的3′ 非翻译区，发生C 向T 的突变后会影响miRNAs 与3′非翻译区的结合及对基因表达的调控，进而可能影响心肌梗死发生后VEGF表达增多对心肌缺血损伤的自身代偿，加重AMI 的病情。在本研究中，不同基因多态性AMI 患者血清心肌酶及VEGF 的分析印证了这一猜想，CT+TT 基因型AMI 患者的血清VEGF 含量低于CC 基因型AMI 患者，CK-MB 及cTnI 峰值高于AMI 患者，说明AMI 发生后虽然存在VEGF 分泌增多的自身代偿机制，但当基因936C/T 位点发生C 向T 的突变时，VEGF 的分泌相对较少、自身代偿也较弱，进而出现了更为严重的心肌缺血缺氧、反应心肌损伤的CK-MB 及cTnI 峰值也较高。

AMI 的发生与环境、饮食、遗传等多种因素有关，本研究对AMI 患者除了VEGF 外的其他多种指标也进行了分析，结果显示：AMI 组患者的年龄、吸烟率、高血压率、糖尿病率、高脂血症率、高Hcy 血症率及血清TC、LDL-C 水平均较高；经Logistic 回归分析发现：年龄、吸烟、高血压、糖尿病、高脂血症、高Hcy 血脂是AMI 的危险因素，这与既往多项关于AMI 发病危险因素的研究［16-18］吻合，年龄、吸烟、血压、血糖、血脂、血Hcy 均会影响AMI 的发生。但是在不同VEGF基因多态性的AMI 患者中，血糖、血脂、血Hcy 的水平无明显差异，说明VEGF基因多态性虽然会影响VEGF 的分泌及心肌损伤的严重程度，但是对血糖、血脂、血Hcy 的代谢并无影响。此外，本研究通过Logistic回归分析还发现：VEGF基因936C/T 位点CT+TT基因型是AMI 的危险因素，CT+TT 基因型患者发生AMI 的风险是CC 基因型患者的1.774 倍。但是，VEGF基因发生上述突变后对VEGF 表达及分泌的直接影响、可能通过靶向VEGF基因936C/T位点的miRNAs 等均有待阐明。

综上所述，本研究发现VEGF基因936C/T位点多态性与AMI 的发生有关，VEGF基因CT+TT基因型是AMI 的危险因素，等位基因T 可能是AMI 发生的易感等位基因。本研究的结果对筛查AMI 的高危人群具有一定指导价值。但是，本研究未对AMI 患者的长期预后进行随访，根据VEGF 的代偿功能，VEGF基因CT+TT 基因型可影响VEGF 的分泌及其代偿功能，进而可能在长期病情转归中产生影响，因此今后可进一步延长随访时间、分析VEGF基因多态性对远期主要心血管事件的影响。