子宫内膜癌组织XIAP、Smac、XAF-1表达变化及其临床意义

冯海利，侯亮，姜琳娜

1 武安市第一人民医院，河北武安056300；2 邯郸市第一人民医院

子宫内膜癌是起源于子宫内膜上皮的恶性肿瘤，是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，其发病率和病死率分别居女性恶性肿瘤的第8、9位[1，2]。近年来，子宫内膜癌的发病率逐年上升并呈年轻化趋势，已成为威胁我国女性健康的主要生殖系统恶性肿瘤之一[3]。手术治疗是子宫内膜癌最主要的治疗方式，但部分患者术后出现复发或转移，即使经正规放化疗，预后仍然较差。目前，子宫内膜癌发生、发展的分子机制尚不完全清楚。因此，探索与子宫内膜癌发生、发展相关的分子对其早期诊断和预后判断具有重要意义。X染色体连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)基因定位于人染色体Xq25，其编码蛋白属于凋亡抑制蛋白家族，能够通过抑制半胱天冬酶(Caspase)蛋白活性，产生凋亡抑制作用[4]。研究发现，乳腺癌、甲状腺癌等肿瘤均存在XIAP异常表达现象，且其异常表达与患者预后不良有关，有可能成为肿瘤诊断和预后判断的分子标志物[5]。线粒体促凋亡蛋白(Smac)基因定位于人染色体12q24.31，其编码蛋白主要分布在线粒体中，在凋亡相关信号刺激下，逐渐从线粒体中释放并进入细胞质中，通过氨基末端与XIAP相互结合激活半胱氨酸蛋白酶，诱导细胞凋亡[6]。研究发现，Smac低表达能够抑制肿瘤细胞凋亡，并促进肿瘤细胞无限增殖和抗药性产生[7]。X染色体连锁凋亡抑制蛋白相关因子1(XAF-1)基因定位于人染色体17p13.1，其编码蛋白在细胞质和细胞核中均有分布，可与XIAP结合，从而拮抗XIAP的抗凋亡作用，进而促进细胞凋亡。研究表明，XAF-1低表达可促进肿瘤细胞增殖并抑制其凋亡[8]。由此推测，XIAP、Smac、XAF-1可能参与子宫内膜癌的发生、发展，但目前相关报道较少。为此，本研究观察了子宫内膜癌组织XIAP、Smac、XAF-1 mRNA表达变化，并探讨其临床意义。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016年2月～2018年12月武安市第一人民医院收治的子宫内膜癌患者90例。所有患者经术后组织病理检查明确诊断。纳入标准：①符合子宫内膜癌诊断；②初诊；③接受子宫切除手术；④入院前未接受任何抗肿瘤治疗；⑤临床病理资料完整。排除标准：①合并其他部位恶性肿瘤者；②心、肝、肺等重要脏器严重功能障碍者；③妊娠期或哺乳期妇女。患者年龄33～72(49.1±10.1)岁，其中<60岁68例、≥60岁22例；肿瘤直径2～11(5.1±1.3)cm，其中≤5 cm 59例、>5 cm 31例；子宫肌层浸润58例，未侵及子宫肌层32例；临床分期：Ⅰ、Ⅱ期67例，Ⅲ、Ⅳ期23例；病理类型：腺癌54例，腺鳞癌14例，乳头状腺癌12例，透明细胞癌10例；组织分化程度：高中分化52例，低未分化38例；有淋巴结转移17例，无淋巴结转移73例。本研究经武安市第一人民医院医学伦理委员会批准，患者或其家属知情同意。

1.2 XIAP、Smac、XAF-1 mRNA表达检测 采用RT-qPCR法。取手术切除的子宫内膜癌组织及其配对的癌旁正常组织(距肿瘤组织边缘>5 cm且经组织病理检查证实为正常子宫内膜组织)，采用TRIzol法提取组织总RNA，经NanoDrop 2000超微量分光光度计鉴定，OD260/OD280为1.8～2.0，可用于后续实验。按TaqMan miRNA反转录试剂盒说明，将总RNA反转录为cDNA；反转录条件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。以cDNA为模板，按SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒说明进行PCR扩增。所有引物由上海吉玛制药技术有限公司设计合成。引物序列：XIAP上游引物5′-TGGTTCAGGATGCGCTGCTC-3′，下游引物5′-CCAAACATGATGACGGCACA-3′；Smac上游引物5′-GCTGCGCAGCTCAAGGGTCT-3′，下游引物5′-GCATCGTGACTGTGGGGAGC-3′；XAF-1上游引物5′-CCTTGGTTTGGGGTGAGAAGC-3′，下游引物5′-AGCCTCCCTGCCTGTCCATC-3′；GAPDH上游引物5′-TCTCTCAGATGTAACTGAGCTG-3′，下游引物5′-TAGCTCATCAACCGATCT-3′。PCR反应体系共20 μL：cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，20×SYBR Green 1 μL，dNTPs 1 μL，DEPC水14.8 μL；反应条件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 10 s共40个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 子宫内膜癌组织与癌旁正常组织XIAP、Smac、XAF-1 mRNA表达比较 子宫内膜癌组织与癌旁正常组织XIAP mRNA相对表达量分别为25.84±2.73、5.16±1.04，Smac mRNA相对表达量分别为6.17±1.26、16.83±4.28，XAF-1 mRNA相对表达量分别为3.29±0.87、22.68±5.37。子宫内膜癌组织XIAP mRNA相对表达量明显高于癌旁正常组织，而Smac、XAF-1 mRNA相对表达量明显低于癌旁正常组织(t分别为67.156、22.667、33.814，P均<0.01)。

2.2 子宫内膜癌组织XIAP、Smac、XAF-1 mRNA表达与患者临床病理特征的关系 子宫内膜癌组织XIAP、Smac、XAF-1 mRNA相对表达量均与子宫肌层浸润、临床分期、组织分化程度、淋巴结转移有关(P均<0.05)，而与年龄、肿瘤直径、病理类型无关(P均>0.05)。见表1。

2.3 子宫内膜癌组织XIAP、Smac、XAF-1 mRNA表达的关系 子宫内膜癌组织XIAP mRNA相对表达量与Smac、XAF-1 mRNA相对表达量均呈负相关关系(r分别为-0.615、-0.667，P均<0.01),Smac mRNA相对表达量与XAF-1 mRNA相对表达量呈正相关关系(r=0.697，P<0.01)。见图1。

3 讨论

子宫内膜癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，全球发病率已达到28.7/10万。我国子宫内膜癌的发病率处于较低水平，但近年有逐渐升高趋势[9]。目前，子宫内膜癌的发病机制尚不完全清楚，其发病机制主要有肿瘤干细胞假说、肿瘤免疫逃逸假说、肿瘤抗凋亡假说等。因此，探索与子宫内膜癌发生、发展相关的分子对其早期诊断和预后判断具有重要意义。

XIAP是由Peter等学者于1996年通过PCR技术和Southern杂交克隆出来的一种凋亡抑制蛋白。在正常细胞中，XIAP通过与凋亡启动因子和凋亡效应因子结合，从而发挥抗凋亡作用。近年研究表明，在乳腺癌、胃癌等肿瘤中均存在XIAP异常高表达现象，其高表达通过激活磷脂酰肌醇3-激酶信号通路，促进肿瘤恶性进展[10]。由此推测，XIAP在子宫内膜癌中可能同样发挥凋亡调控作用。本研究结果发现，子宫内膜癌组织XIAP mRNA相对表达量高于癌旁正常组织，提示XIAP高表达可能参与子宫内膜癌形成，其机制可能与在肿瘤组织中长链非编码RNA XIAP-AS1能够促进XIAP表达有关。研究表明，长链非编码RNA XIAP-AS1能够与转录因子Sp1相互作用并结合于XIAP基因启动子区，从而促进XIAP表达[11]。本研究结果发现，子宫内膜癌组织XIAP mRNA相对表达量与子宫肌层浸润、临床分期、组织分化程度、淋巴结转移有关，而与年龄、肿瘤直径、病理类型无关，提示XIAP异常表达可能与子宫内膜癌恶性进展有关。其机制一方面可能是XIAP高表达能够提高肿瘤细胞对凋亡的抗性。XIAP主要通过其杆状病毒IAP重复序列(BIR)结构域与Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9相互结合，抑制其促凋亡活性并促进肿瘤细胞的生存和增殖[12]。另一方面，XIAP表达受微小RNA(miRNA)调控，如miR-181a等，miRNA在调控XIAP表达的同时，能够调控上皮间质转化过程中的关键转录因子Snail1表达，使E-钙黏素等上皮表型蛋白表达减少，而波形蛋白等间质表型蛋白表达增加，从而促进肿瘤恶性进展[13,14]。

表1 子宫内膜癌组织XIAP、Smac、XAF-1 mRNA表达与患者临床病理特征的关系

图1 子宫内膜癌组织XIAP、Smac、XAF-1 mRNA表达的关系

Smac基因定位于人染色体12q24.31，其编码蛋白是一种由线粒体释放的促凋亡因子。生理条件下，Smac通过激活Caspase信号通路，诱导肿瘤细胞凋亡。XAF-1基因定位于人染色体17p13.1，其编码蛋白主要分布于细胞质和细胞核中。生理条件下，XAF-1能够与细胞质中的XIAP结合，抑制XIAP的抗凋亡作用，从而促进细胞凋亡[15]。同时，XAF-1还能调控TNFR信号通路、线粒体内源性信号通路，促进肿瘤细胞程序性死亡，增强肿瘤细胞程序性死亡的敏感性。有研究报道，肺癌、肝癌等恶性肿瘤组织均存在Smac、XAF-1低表达现象[16]。本研究发现，子宫内膜癌组织Smac、XAF-1 mRNA相对表达量低于癌旁正常组织，提示二者异常表达可能与子宫内膜癌发生有关，其机制可能与Smac、XAF-1基因启动子区的表观遗传学修饰有关。有研究发现，在肿瘤细胞中DNA甲基转移酶1表达升高，可促进Smac、XAF-1基因启动子区CpG岛的异常高甲基化，从而抑制Smac、XAF-1基因转录，最终导致Smac、XAF-1基因表达沉默[17]。有研究还发现，去甲基化酶能够使Smac启动子区甲基化水平降低，从而恢复Smac的促细胞凋亡作用[18]。本研究结果发现，子宫内膜癌组织Smac、XAF-1 mRNA相对表达量均与子宫肌层浸润、临床分期、组织分化程度、淋巴结转移有关，而与年龄、肿瘤直径、病理类型无关。提示Smac、XAF-1异常表达与子宫内膜癌恶性进展有关，其机制尚不清楚，有可能是XAF-1、Smac表达降低能够引起NF-κB信号通路活化，导致信号转导和转录激活因子3表达升高，促进下游血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶基因表达增加，最终导致肿瘤侵袭和转移[19]。

本研究结果发现，子宫内膜癌组织XIAP mRNA相对表达量与Smac mRNA相对表达量呈负相关关系，其原因是XIAP与Smac在功能上存在拮抗作用，XIAP的BIR-3结构域能与Smac、Caspase中的AVP1结构域结合，而Smac能够抑制XIAP与Caspase结合。本研究结果发现，子宫内膜癌组织XIAP mRNA相对表达量与XAF-1 mRNA相对表达量呈负相关关系，与以往报道[6]一致，其原因是XAF-1与XIAP结合能够使细胞核中XIAP表达降低，从而发挥抑制IAPs家族蛋白功能的作用[20]。本研究结果发现，子宫内膜癌组织Smac mRNA相对表达量与XAF-1 mRNA相对表达量呈正相关关系，提示二者可能协同促进子宫内膜癌的发生、发展。有研究报道，XAF-1、Smac均能通过激活TNF-α信号通路促进细胞凋亡[21]。但三者在子宫内膜癌中的相互作用机制尚不完全清楚，有待于进一步研究。

综上所述，子宫内膜癌组织XIAP表达上调，Smac、XAF-1表达下调，三者表达变化可能共同促进肿瘤的发生、发展。