miR-219a-5p对皮肤鳞状细胞癌细胞凋亡的影响及机制

林永丽 杨灿 李艳

皮肤鳞状细胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma，CSCC）是常见的皮肤恶性肿瘤之一。目前的治疗方式还是以手术为主，放化疗为辅[1]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类非编码RNA，可通过调控靶基因的表达影响细胞增殖、分化和凋亡等生命过程[2]。据报道miRNA参与了皮肤肿瘤的发生发展，研究miRNA对在其中的作用机制，有利于皮肤肿瘤诊断和治疗[3]。miR-219a-5p可抑制乳腺癌细胞迁移和上皮-间质转化[4]；miR-219a-5p可抑制恶性黑素瘤的生长和转移[5]。染色质结构维持蛋白4（structuralmaintenance of chromosome 4，SMC4）是SMC家族成员之一，主要参与染色体高级结构动态变化，与肿瘤的发生过程有关[6]。干扰SMC4表达可抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力[7]。Wnt信号通路是一种基础信号通路，调控细胞增殖、分化，影响细胞凋亡[8]；Wnt/βcatenin是Wnt中重要的信号调节通路，参与多种人类肿瘤的发生发展[9]。Wnt/β-catenin信号通路的异常激活可导致鼻咽癌的发生发展[10]；miR-200a抑制Wnt/β-catenin通路可以缓解肾间质纤维化[11]。但miR-219a-5p对CSCC增殖、凋亡的影响及其机制是否与SMC4、Wnt/β-catenin通路有关还尚未清楚，本实验旨在研究miR-219a-5p对CSCC增殖、凋亡的影响以及miR-219a-5p是否通过调控SMC4、Wnt/βcatenin信号通路影响CSCC的增殖和凋亡。

1 材料与方法

1.1 材料

皮肤鳞状细胞癌细胞HSC-2、Colo-16、SCL-1和人正常皮肤细胞HaCaT均购自中国科学院上海细胞库；胎牛血清、RPMI-1640培养基购自美国Sigma公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京Solarbio公司；MTT试剂盒、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）和碘化丙锭（PI）试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。抗体均购自上海煊翎生物科技有限公司。FACSCalibur流式细胞仪购自美国BD公司；ThermoFC酶标仪购自美国Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

皮肤鳞状细胞癌细胞HSC-2、Colo-16、SCL-1和人正常皮肤细胞HaCaT用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养，每天换液一次，待细胞融合至80%左右时，加入0.25%的胰蛋白酶进行消化传代，选取处于对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2 细胞转染与分组

取对数生长期细胞HSC-2，用无血清培养基同步化12h后，将miR-con、miR-219a-5p、anti-miR-con和anti-miR-219a-5p分别转染至细胞HSC-2中，记为miR-con组、miR-219a-5p组、anti-miR-con组和antimiR-219a-5p组；未进行任何处理的细胞HSC-2作为空白对照组（NC）；将miR-219a-5p分别与pcDNA和pcDNA-SMC4共同转染至细胞HSC-2中，记为miR-219a-5p+pcDNA组和miR-219a-5p+pcDNASMC4组，转染均按照LipofectamineTM2000试剂盒进行操作，均转染培养48 h，每组实验重复3次。

1.2.3 qRT-PCR检测miR-219a-5p和SMC4mRNA表达水平

收集以上培养48 h后的各组细胞，研磨充分后加入Trizol试剂提取总RNA，微量核酸测定仪检测RNA纯度和浓度。使用Ta Ka Ra反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，按照Ta Ka Ra荧光定量试剂盒使用说明配制反应体系，以β-actin为内参进行PCR扩增，每个样品重复3次，循环条件为95℃3min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，共40个循环；72℃延伸5min。相对表达量采用2-△△Ct法计算。

1.2.4 Westernblot检测SMC4、CyclinD1、Caspase-3、Wnt2、β-catenin蛋白的表达

收集以上培养48 h后的各组细胞，加入RIPA裂解液裂解，4℃，12000g离心15min，收集蛋白上清液，BCA试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白样品进行SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭液室温封闭1h。分别加入一抗（1∶1000），4℃孵育过夜，TBST洗膜；加入二抗（1∶2000）室温孵育2h，TBST洗涤3次，每次10min，后在暗室中曝光显影，再浸入定影，最后洗去残液晾干，将胶片用Quantity One凝胶分析软件处理，测定各组蛋白条带的吸光度，以目的条带和β-actin条带的比值作为蛋白表达水平。实验重复3次。

1.2.5 MTT检测细胞活性

各组细胞培养至48h时加入20μL的MTT溶液，继续孵育4 h；弃去多余培养基并加入150μL DMSO振荡反应10min，酶标仪检测490nm处吸光度（OD）值。细胞存活率（%）=实验组OD值/空白对照组OD值×100%。

1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡

用不含EDTA的胰酶消化培养48 h后的各组细胞后离心收集，PBS漂洗2次，加结合缓冲液重悬细胞。依据试剂盒说明书，先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育15min。流式细胞仪检测激发波长488nm和发射波长530nm处的荧光强度。实验重复3次。

1.2.7 荧光素酶报告基因检测实验检测miR-219a-5p对SMC4的靶向调控

TargetScan数据库显示SMC43′UTR区域有miR-219a-5p结合位点。构建野生型和突变型基因靶点SMC4的3′UTR荧光素酶表达载体（SMC4-WT和SMC4-MT），将SMC4-WT和SMC4-MT载体质粒分别与miR-con和miR-219a-5p共转染至HSC-2细胞中，具体转染步骤按LipofectamineTM2000试剂盒说明进行实验重复3次。

1.2.8 统计学分析

采用SPSS 20.0进行统计学分析。计数资料用%表示，计量资料以（±s）表示，两组比较行t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-219a-5p和SMC4在皮肤鳞状细胞癌细胞株中的表达

与人正常皮肤细胞HaCaT相比，皮肤鳞状细胞癌细胞HSC-2、Colo-16、SCL-1中miR-219a-5p的表达水平显著降低，SMC4mRNA和蛋白的表达水平显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）（图1，表1）。

图1 皮肤鳞状细胞癌细胞株中SMC4蛋白表达结果Figure1 Expression of SMC4 protein in skin squamous cell carcinoma cell lines

表1 皮肤鳞状细胞癌细胞株中miR-219a-5p和SMC4的表达[n=9，（±s）]Table1 Expression ofmiR-219a-5p and SMC4 in squamous cell carcinoma cell lines[n=9，（±s）]

表1 皮肤鳞状细胞癌细胞株中miR-219a-5p和SMC4的表达[n=9，（±s）]Table1 Expression ofmiR-219a-5p and SMC4 in squamous cell carcinoma cell lines[n=9，（±s）]

注：与HaCaT组比较，aP＜0.05，aP＜0.05vs HaCaT group。

分组HaCaT HSC-2 Colo-16 SCL-1 F值P值miR-219a-5p 1.00±0.080.35±0.05a 0.25±0.09a 0.41±0.11a 141.4740.000SMC4mRNA 1.00±0.031.86±0.09a 2.05±0.12a 1.73±0.13a 188.3670.000SMC4 protein 1.00±0.072.15±0.12a 2.23±0.14a 2.03±0.14a 202.9280.000

2.2 转染miR-219a-5p诱导皮肤鳞状细胞癌细胞的凋亡

与miR-con组相比，miR-219a-5p组皮肤鳞状细胞癌中miR-219a-5p的表达水平显著升高，Cyclin D1表达水平显著降低，Caspase-3表达水平显著升高，细胞存活率显著降低，细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）（表2）。

2.3 miR-219a-5p过表达对Wnt/β-catenin信号通路的影响

与miR-con组相比，miR-219a-5p组皮肤鳞状细胞癌中Wnt2、β-catenin表达水平显著降低，GSK3β表达水平显著升高（P＜0.05）（表3）。

表2 转染miR-219a-5p对皮肤鳞状细胞癌HSC-2细胞中miR-219a-5p、CyclinD1、Caspase-3的表达量和凋亡的影响[n=9，（±s）]Table2 Effect of transfection ofmiR-219a-5p on expression ofmiR-219a-5p，CyclinD1，Caspase-3and apoptosis in squamous cell carcinoma HSC-2 cells[n=9，（±s）]

表2 转染miR-219a-5p对皮肤鳞状细胞癌HSC-2细胞中miR-219a-5p、CyclinD1、Caspase-3的表达量和凋亡的影响[n=9，（±s）]Table2 Effect of transfection ofmiR-219a-5p on expression ofmiR-219a-5p，CyclinD1，Caspase-3and apoptosis in squamous cell carcinoma HSC-2 cells[n=9，（±s）]

分组NC miR-con miR-219a-5p F值P值miR-219a-5p 1.00±0.050.92±0.09 3.35±0.34a 407.7030.000细胞存活率99.56±4.3689.85±4.0251.86±3.25a 375.1740.000凋亡率4.56±1.356.25±1.48 28.46±1.94a 617.6400.000CyclinD11.00±0.060.85±0.090.35±0.12a 119.8280.000Caspase-31.00±0.08 1.21±0.112.97±0.37203.3570.000

表3 转染miR-130a-3p对皮肤鳞状细胞癌HSC-2细胞对Wnt/β-catenin信号通路的影响[n=9，（x±s）]Table3 Effect of transfection ofmiR-130a-3p onWnt/βcatenin signaling pathway in squamous cell carcinoma HSC-2 cells[n=9，（±s）]

表3 转染miR-130a-3p对皮肤鳞状细胞癌HSC-2细胞对Wnt/β-catenin信号通路的影响[n=9，（x±s）]Table3 Effect of transfection ofmiR-130a-3p onWnt/βcatenin signaling pathway in squamous cell carcinoma HSC-2 cells[n=9，（±s）]

注：与miR-con组比较，aP＜0.05，aP＜0.05vs miR-con group。

分组NC miR-con miR-219a-5p F值P值miR-219a-5p 1.00±0.030.99±0.075.78±0.58a 602.1820.000Wnt21.00±0.050.88±0.090.34±0.06a 235.0140.000β-catenin 1.00±0.070.95±0.090.42±0.13a 93.2810.000GSK3β 1.00±0.041.05±0.09 2.54±0.21a 384.2730.000

2.4 miR-219a-5p靶向SMC4抑制SMC4蛋白的表达

TargetScan数据库预测到SMC4与miR-219a-5p存在结合位点（图4A）。荧光素酶报告基因检测实验结果（表4）显示，相较于miR-con组，miR-219a-5p组SMC4-WT细胞HSC-2的荧光素酶活性显著降低（P＜0.05）；而SMC4-MT细胞HSC-2的荧光素酶活性差异不显著。Western Blot检测结果（图4 B）显示，相较于miR-con组，miR-219a-5p组HSC-2细胞中SMC4表达水平显著降低；相较于anti-miR-con组，anti-miR-219a-5p组HSC-2细胞中SMC4表达水平显著升高（P＜0.05）。

图4 miR-219a-5p靶向SMC4的蛋白表达结果Figure4 miR-219a-5p targets SMC4

表4 miR-con或miR-219a-5p与报告质粒共转染皮肤鳞状细胞癌HSC-2细胞后双荧光素酶活性检测（n=9）Table4 Detection of dual luciferase activity after co-transfection of skin squamous cell carcinoma HSC-2 cellswithmiR-con ormiR-219a-5p and reporter plasmid（n=9）

2.5 过表达SMC4逆转miR-219a-5p诱导皮肤鳞状细胞癌的凋亡

与miR-con组相比，miR-219a-5p组SMC4、Cyclin D1表达水平显著降低，Caspase-3表达水平显著升高，细胞存活率显著降低，细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）；与miR-219a-5p+pcDNA组相比，miR-219a-5p+pcDNA-SMC4组SMC4、CyclinD1表达水平显著升高，Caspase-3表达水平显著降低，细胞存活率显著升高，细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）见表5，图5。

表5 Wes ternblot检测皮肤鳞状细胞癌HSC-2细胞中SMC4的蛋白表达（n=9）Table5 Western blotanalysis of SMC4 protein expression in skin squamous cell carcinoma HSC-2 cells（n=9）

图5 Wes ternblot检测皮肤鳞状细胞癌HSC-2细胞中SMC4、CyclinD1和Caspase-3的表达Figure5 Western blotanalysis of SMC4,CyclinD1and Caspase-3expression in skin squamous cell carcinoma HSC-2 cells

3 讨论

CSCC发病率逐年上升，且易转移，对人类生命健康威胁极大[12]。miRNA在多种恶性肿瘤发生发展中发挥重要作用[13]。研究发现miR-219-5p可抑制非小细胞肺癌的增殖和侵袭并促进其凋亡[14]。miR-219-5p过表达通过上调Cleaved Caspase-3蛋白表达可抑制胰腺癌细胞增殖和侵袭，并诱导细胞凋亡[15]。本研究结果表明，miR-219a-5p在CSCC细胞系中均低表达，过表达miR-219a-5p可抑制CSCC细胞增殖，诱导细胞凋亡；促进Caspase-3表达，抑制CyclinD1表达。

SMC4属于SMC染色体ATP酶家族，SMC4在肺腺癌组织中过表达，敲低SMC4显著抑制A549细胞的增殖和侵袭[16]。SMC4的过表达可激活TGFβ/Smad信号传导并促进胶质瘤细胞的侵袭[17]；SMC4在肝癌细胞中上调表达，miR-219可降低SMC4的表达，而SMC4又下调JAK2/Stat3的表达[18]。本研究中SMC4在CSCC中也上调表达，且miR-219a-5p也调控SMC 4的表达，过表达SMC4还能逆转miR-219a-5p对细胞HSC-2的增殖抑制和凋亡促进的作用。

研究发现Wnt/β-cat enin信号通路可与miRNA相互作用、调控进而影响肿瘤的发生发展。有研究报道miR-219-5p通过靶向LRH-1/Wnt/β-catenin信号通路可抑制胃癌细胞的增殖，迁移和侵袭[19]；miR-219-5p通过靶向Twist/Wnt/β-catenin信号通路也能抑制上皮性卵巢癌细胞的增殖，迁移和侵袭[20]；此外Sox9介导Wnt/β-catenin信号通路还影响皮肤鳞癌细胞的增殖[21]。本实验结果表明，miR-219a-5p过表达会抑制CSCC中Wnt2、β-catenin和Cyclin D1蛋白表达，Cyclin D1又是Wnt/β-catenin通路下游调控因子，即miR-219a-5p过表达会抑制Wnt/β-catenin信号通路，提示miR-219a-5p过表达影响CSCC细胞增殖、凋亡可能与Wnt/β-catenin信号通路有关。

综上所述，miR-219a-5p抑制皮肤鳞状细胞癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，其机制可能与SMC4及Wnt/β-catenin信号通路有关，将可为皮肤鳞状细胞癌的预防和治疗提供新思路和新靶点。