TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ在POP患者子宫主韧带组织中的表达及意义

张凯 薛惠英 张雪芹

流行病学研究证实，盆腔器官脱垂（pelvic organ prolapse，POP）的发病率可超过473～684/1万女性左右[1]。临床上POP的发生，能够导致子宫脱垂、阴道前后壁脱垂及压力性尿失禁的发生，导致女性患者生活质量的显著下降[2]。

对于POP的病因探讨具有重要的意义，其能够深入揭示POP的发病机制，从而为疾病的预防提供理论参考。生物学因子指标的表达，能够通过影响到盆腔内韧带的张力、纤维组织的顺应性及胶原纤维的修复，进而参与到女性POP的发生过程。转化生长因子-1（Transforming growth factor，TGF-β1）能够促进盆地纤维细胞的损伤修复，促进间质细胞增生，提高盆底组织的抗张力和抗机械性应力的能力[3]；基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMP）的表达，能够通过促进细胞间质成分蛋白酶的激活，促进细胞间质的分解，导致细胞间质成分中胶原成分的降解，导致盆底脏器组织脱垂风险的上升[4]；胶原蛋白Ⅲ型（CollagenⅢ）的表达浓度的上升能够降低韧带组织的韧性，提高韧带组织对于子宫及阴道前后壁的支撑能力，增加组织的抗张力强度[5]。为了揭示TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ的表达与POP的关系，从而为临床上POP的诊疗提供理论方面的参考，本次研究搜集POP患者45例，探讨了TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ在主韧带组织中的表达情况，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年1月至2018年5月在本院治疗的POP患者45例（POP组），其中Ⅲ期25例，Ⅳ期20例。纳入标准：①诊断符合盆腔器官脱垂定量分期法（Quantitative staging of pelvic organ prolapse，POP-Q）中的Ⅲ和Ⅳ期患者；②经尿动力检查无尿失禁；③在我院行手术治疗；④术后病理证实为非子宫内膜异位症等雌激素相关疾病；⑤患者及家属知情同意。排除标准：①有松皮病、肺气肿等弹性纤维异常疾病；②有生殖道、泌尿系统感染；③近期3个月服用过激素类药物。同时选取因宫颈上皮内瘤变或良性肿瘤行子宫切除的无POP患者50例作为对照组，观察组和对照组年龄、产次等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。本次研究所有患者均知情同意，并获得医院伦理委员会批准。

表1 两组一般资料比较[n，（±s）]Table1 Comparison of basic data in 2 groups[n，（±s）]

表1 两组一般资料比较[n，（±s）]Table1 Comparison of basic data in 2 groups[n，（±s）]

组别POP组对照组t/χ2 值P值n 4550年龄（岁）54.92±8.2955.10±9.100.1000.920产次1.78±0.471.70±0.500.8010.425体重指数（kg/m2）22.98±3.2023.01±3.110.0460.963绝经情况绝经前26 300.0480.826绝经后19 20

1.2 实验方法

免疫组化法检测TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ的表达：采用石蜡包埋组织进行连续性切片，脱蜡至水后采用H2O2室温下孵育10min，磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次3～5min，8%的蛋白粉封闭液（商品名：BSA购自南京博奥生物科技公司），封闭2 h，倒去封闭液后加入TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ一抗（兔来源 浓度1∶1000～1500其中TGFβ1、MMP-3抗体购自abcam公司，CollagenⅢ抗体购自上海泰康生物公司），4℃冰箱过夜，磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次3～5min，加入二抗（鼠来源1∶400～500购自南京博奥生物公司），室温孵育20～30min，冲洗3次，每次3～5min，加入辣根酶或碱性磷酸酶的标记物，室温孵育10min，冲洗3次，每次3～5min，滴加显色剂（DAB购自南京博奥生物科技公司），复染，脱水，封片。

读片评分标准：①根据着色强度：0分为无色、1分为淡黄色、2分为棕黄色、3分为褐色、黑色；②根据阳性细胞比例：阳性细胞数目所占比例≤10%为1分、阳性细胞所占比例11%～50%为2分、阳性细胞数51%～75%为3分、阳性细胞数所占比例＞75%为4分，两种积分相乘总分＜3分为阴性、≥3分为阳性。

Western blot检测相关指标的表达灰度值：将所研磨的子宫韧带组织蛋白与上样缓冲液以5∶1的浓度相互混合，80～100℃煮沸5min。根据不同的蛋白分子量水平，配制并灌注相应的12%的分离胶和5%的浓缩胶，按15g/孔蛋白量进行组织蛋白的上样，进行SDS.PAGE电泳，电泳后根据条带进行切胶，半湿法转移至硝酸纤维素膜，BSA蛋白封闭2h，加入含10%BSA一抗及二抗（1∶1000），磷酸盐缓冲液清洗3次，每次5min，采用仪器读取平均灰度值。

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0软件，计数资料比较使用χ2检验，计量资料采用（±s）表示，组间比较使用t检验，相关性采用pearson相关分析，检验水准α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 POP组和对照组TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ表达比较

POP组TGF-β1和CollagenⅢ阳性表达率明显低于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），而MMP-3阳性表达率明显高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表2，POP组TGF-β1和CollagenⅢ表达平均灰度值明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），而MMP-3平均灰度值明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ的阳性着色均表达于细胞质，呈黄色、棕黄色、褐色表达，见图1。

表2 POP组和对照组TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ性表达情况比较[n（%）]Table2 Comparison of TGF-β1，MMP-3and collagenⅢpositive expression between pop group and controlgroup[n（%）]

表3 POP组和对照组TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ表达灰度值比较Table3 Comparison of expression gray values of TGF-β1，MMP-3and collagenⅢbetween pop group and controlgroup

图1 各组子宫主韧带组织中TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ表达免疫组化图Figure1 expression of TGF-β1，MMP-3and collagenⅢin themain ligament of uterus of each group

2.2 POP组绝经前及绝经后TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ表达比较

POP组绝经后患者TGF-β1和CollagenⅢ阳性表达率明显低于绝经前患者，差异有统计学意义（P＜0.05），而MMP-3阳性表达率明显高于绝经前患者，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 POP组绝经前及绝经后TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ阳性表达率比较[n（%）]Table4 Comparison of the expression of TGF-β1，MMP-3and collagenⅢin the pop group before and aftermenopause[n（%）]

POP组绝经后患者TGF-β1和CollagenⅢ表达平均灰度值明显低于绝经前患者，而MMP-3平均灰度值明显高于绝经前患者，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表5。

表5 POP组绝经前及绝经后TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ表达灰度值比较[n（%）]Table5 Comparison of expression gray values of TGF-β1，MMP-3and collagenⅢin pop group before and after menopause[n（%）]

2.3 POP组不同分期患者TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ表达比较

POP组Ⅳ期患者TGF-β1和CollagenⅢ阳性表达率明显低于Ⅲ期患者，有统计学意义（P＜0.05），而MMP-3阳性表达率明显高于Ⅲ期患者，有统计学意义（P＜0.05），见表6。POP组Ⅳ期患者TGF-β1和CollagenⅢ表达平均灰度值明显低于Ⅲ期患者，有统计学意义（P＜0.05），而MMP-3平均灰度值明显高于Ⅲ期患者，有统计学意义（P＜0.05），见表7。

表6 POP组不同分期患者TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ阳性率比较[n（%）]Table6 Comparison of TGF-β1，MMP-3and collagenⅢexpression in differentstages of pop group[n（%）]

表7 POP组不同分期患者TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ表达灰度值比较[n（%）]Table7 Comparison of expression gray values of TGF-β1，MMP-3and collagenⅢin pop group atdifferentstages[n（%）]

2.4 相关分析

将POP患者TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ表达灰度值进行相关分析，结果显示：TGF-β1、CollagenⅢ与MMP-3呈负相关（r=-0.563，-0.677；P＜0.05），TGF-β1与CollagenⅢ呈正相关（r=0.441，P＜0.05）。

3 讨论

子宫主韧带是维持子宫盆腔内脏器位置，支持子宫及阴道前后壁解剖结构的重要韧带，子宫主韧带张力的下降或者韧带组织的松弛，能够显著促进POP的发生，导致子宫脱垂和阴道前后壁脱垂的发生。不同的生物学机制，均能够促进子宫主韧带张力和抗机械性应力能力的改变，导致韧带弹性的下降。TGF-β1是生长因子家族成员，其能够通过促进韧带间质细胞的增生和修复，提高韧带的纤维细胞密度，改善韧带的弹性和张力；MMP-3是金属基质蛋白酶超家族成员，其能够参与到炎症、自身免疫性疾病或者恶性肿瘤的发生过程，其表达浓度的上升能够促进主韧带间质细胞的分解，导致胶原细胞含量的减少，胶原密度的下降，从而促进了脏器脱垂的发生[9]；CollagenⅢ是维持盆底支持结构的重要细胞间质成分，其能够稳定胶原纤维的张力，提高子宫主韧带的顺应性[10]。

本次研究发现在子宫主韧带组织中，TGF-β1、CollagenⅢ的表达阳性率及平均灰度值均较未脱垂的女性明显下降，而MMP-3的表达阳性率及平均灰度值则明显上升，提示了TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ的表达异常均能够参与到POP的发生发展过程。这主要由于TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ的病理性作用有关[11-12]：①TGF-β1或者CollagenⅢ的下降，能够导致子宫主韧带间质细胞成分中胶原蛋白Ⅳ、Ⅵ及Ⅷ新生能力的不足，导致胶原蛋白抗张力能力的下降；②MMP-3的上升，能够通过诱导细胞间质胶原蛋白酶的激活，促进胶原蛋白的分解，导致主韧带组织中胶原厚度和数量的减少，从而促进了POP的发生[13]。随后的研究发现，TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ等主要表达于子宫韧带组织细胞质中，推测相关指标主要通过影响到韧带组织细胞内细胞器的功能，进而影响到了POP的病情进展。在绝经后的患者中，TGF-β1及CollagenⅢ的表达阳性率及平均灰度值明显的下降，而MMP-3的表达阳性率及平均灰度值明显的上升，提示绝经对于POP女性主韧带组织中不同生物学因子的影响，这主要由于绝经后，体内性激素水平的波动，能够降低主韧带组织中胶原纤维的分化能力，抑制了TGF-β1及CollagenⅢ的合成。临床分期较晚的患者，其TGF-β1及CollagenⅢ的表达阳性率及平均灰度值明显下降，而MMP-3的表达阳性率及平均灰度值明显上升，提示了相关因子与POP患者的病情严重程度之间存在一定的联系，这主要由于脱垂情况越为严重，间质细胞的修复能力越低，TGF-β1越低，胶原蛋白的含量越少，CollagenⅢ也越少[14]。

本次研究的创新性在于揭示了POP患者主韧带组织中TGF-β1、CollagenⅢ与MMP-3的表达与绝经和临床分期的关系。综上所述，在POP患者中，TGF-β1、CollagenⅢ的表达明显下降，MMP-3的表达明显上升，同时在绝经或者临床分期较晚的患者中，相关因子的差异性表达更为明显。