靶向清除B细胞治疗系统性红斑狼疮

张 倜 综述 张 炯 审校

系统性红斑狼疮(SLE) 是一种病因不明、高度异质性的自身免疫性疾病，目前对SLE的发病机制理解为在易感基因、性激素、环境综合作用下，机体无法有效清除含有核酸的凋亡碎片，激活固有免疫细胞释放干扰素α (IFN-α),进而导致适应性免疫耐受的丢失，表现为T细胞、B细胞的功能亢进、信号传导通路紊乱，形成免疫复合物，激活补体导致组织损伤[1-2]。其中B细胞的功能异常被认为是SLE发病机制的核心环节，深入探索B细胞的功能可给SLE提供新的治疗策略[3]。

B细胞在SLE中通过细胞固有功能、抗体介导及T细胞依赖的机制发挥作用。自身反应性B细胞活化后生成自身抗体，介导抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)以及补体依赖性细胞毒性(CDC)。B细胞作为链接固有免疫和适应性免疫重要的媒介，起到抗原递呈以及共刺激T细胞的作用，此外，B细胞的活化和效应功能受到共刺激分子、信号传导通路、细胞因子的精细调节[4-5]。本文就B细胞及B细胞耗竭理论在SLE发病机制中的作用研究作一综述，并进一步探讨嵌合抗原受体T细胞疗法 (CAR-T) 治疗SLE的可行性及前景性。

B细胞在SLE发病机制中的作用

B细胞数量及信号传导异常与SLE发病机制密切相关。如在活动性SLE外周血中发现初始B细胞减少，关键蛋白如Syk、Btk的磷酸化水平升高，致B细胞的高反应性，产生自身抗体、协同自身反应性T细胞及致病性细胞因子等，促进SLE的发病进程。

产生自身抗体大量研究表明，B细胞分泌自身抗体，促进SLE疾病进展、组织破坏。首先，自身抗体与自身抗原形成免疫复合物沉积于组织，激活补体及CDC效应，造成组织损伤[6]。其次，自身抗体通过ADCC效应，招募效应细胞如巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞Fc受体介导组织损伤。最后，免疫复合物通过Fc受体及Toll样受体(TLRs)双向激活效应细胞。因此B细胞产生自身抗体，可通过多种机制介导SLE的组织损伤[7]。

与T细胞相互作用自身反应性B细胞通过与T细胞相互作用促进SLE的发病。B细胞作为表达的MHC Ⅱ类分子的抗原递呈细胞，递呈自身抗原激活初始CD4+T细胞，进一步分化成滤泡辅助T细胞。在生发中心，滤泡辅助T细胞促进B细胞类别转换，体细胞突变、分化成记忆性B细胞、浆细胞[8]。在SLE小鼠模型中，抗核抗体经过高频体细胞突变后，变成更高亲和力、致病性的自身抗体。研究表明，SLE活动期CD4+T细胞、CD8+T细胞均高表达CD40L，阻断CD40L可缓解NZB/W狼疮小鼠蛋白尿水平、提高预后生存[9]。

释放细胞因子B细胞通过产生大量细胞因子介导免疫炎症反应。B细胞可分泌IFN-γ,白细胞介素6(IL-6),IL-2及抑炎细胞因子IL-10、IL-4。在SLE小鼠模型中，B细胞分泌IL-6及IFN-γ促进生发中心的生存及滤泡辅助T细胞的分化。此外，IL-6可促进B细胞生存、扩增及分化成浆母细胞。目前多靶点治疗(吗替麦考酚酯联合他克莫司)在狼疮性肾炎治疗中取得显著疗效，从转录组学中提示B细胞相关的IL-6的信号传导通路在多靶点治疗组显著受到明显抑制[10]。

从上述三个方面可以看出，B细胞通过多种方式介导SLE的发病及进展(图1)。因此，靶向清除B细胞，从而抑制异常的免疫反应，理论上成为治疗SLE合理的策略。

图2 第一代至第四代CAR-T结构示意图

B细胞耗竭治疗的现状

目前临床上最常用造成B细胞耗竭的是第一代抗CD20单克隆抗体利妥昔单抗，由鼠源性抗CD20单抗可变区Fab和人IgG1抗体恒定区Fc段构成，主要通过补体介导的细胞毒性作用，诱导B淋巴细胞凋亡及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用清除B细胞。利妥昔单抗于1997年美国FDA批准用于复发难治性滤泡性淋巴瘤的治疗，目前利妥昔单抗联合化疗已成为多数B细胞非霍奇金淋巴瘤的标准一线治疗方案。

2009年EXPLORER研究纳入257例无肾脏受累的中重度SLE患者，在激素、免疫抑制剂治疗的基础上，于第1、15、168、182天给予1 000 mg利妥昔单抗治疗；2012年LUNAR研究纳入144例增生型狼疮性肾炎，在激素冲击联合吗替麦考酚酯的基础上，在同样的时间点给予利妥昔单抗治疗，但在这两个大规模随机对照研究中都没有达到主要终点，因此利妥昔单抗并没有获批治疗SLE的适应症[11-12]。

事实上，基于一些回顾性研究、临床使用经验，利妥昔单抗在治疗SLE上有独特的疗效。LESIMAB研究共纳入116例难治性SLE患者，72例(62.9%)在6个月的时候有疗效，其中22例达到完全缓解，51例部分缓解[13]；法国的一项前瞻性多中心观察研究表明，在6个月随访时间点，71%的患者利妥昔单抗治疗后有疗效反应，其中肾脏反应率为74%[14]；英国的一项平均随访4年的回顾性研究纳入115例SLE患者，6个月反应率达到67%[15]。

在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型狼疮性肾炎临床研究中，Condon等[18]在第1天、第15天给予1g RTX联合500 mg甲泼尼龙冲击治疗，序贯霉酚酸酯最高剂量1.5 g/d治疗。随访37周时，90%的患者获得部分或完全缓解，随访至52周时， 52%患者完全缓解，34%患者部分缓解(表1)。进一步分析LUNAR研究中68例利妥昔单抗治疗的患者，53例(78%)患者完成了外周血B淋巴细胞完全清除,其中25例(47%)患者获得完全缓解，而在B细胞未完全清除组中只有2例 (13%)完全缓解，提示在狼疮性肾炎中长时间、迅速清除B细胞与完全缓解明显相关[17]。此外，利妥昔单抗对治疗SLE合并难治的溶血性贫血同样有效。一项纳入21例患者的观察性研究，使用利妥昔单抗治疗1月后血小板计数明显上升，52.3%的患者获得完全缓解，28.6%的患者获得部分缓解[18]。因此，在2019年欧洲抗风湿病联盟指南上仍然推荐在对免疫抑制剂治疗无效或使用禁忌的重症狼疮性肾炎、血液系统、中枢神经系统受累，以及免疫性血小板减少症、溶血性贫血中可尝试使用利妥昔单抗[19]。除利妥昔单抗外，Ofatumumab是全人源性Ⅰ型抗CD20单抗，目前治疗增殖性狼疮性肾炎的Ⅱ期临床实验正在进行中[20]。

表1 利妥昔单抗治疗SLE/LN临床研究汇总

SLE：系统性红斑狼疮；LN:狼疮性肾炎；MP:甲泼尼龙；MMF：吗替麦考酚酯；CTX：环磷酰胺；RTX：利妥昔单抗；a:完全有效率；*：Ⅲ、Ⅳ型

进一步分析利妥昔单抗在SLE治疗的局限性发现，在B细胞分化过程中，CD20只表达在前B细胞至效应性、记忆性B细胞阶段，而分泌自身抗体的浆母细胞并不表达CD20，也就意味着利妥昔单抗并不能有效清除分泌自身抗体的浆细胞[21-22]。其次，利妥昔单抗并不能有效清除骨髓、淋巴组织中的B细胞。研究表明，利妥昔单抗治疗类风湿关节炎患者，在1月、3月分别行骨髓学流式检查发现，利妥昔单抗并不能清除骨髓中分泌自身抗体的CD27(+)IgM(-)IgD(-) 记忆性B细胞，因此通过抗CD20单抗清除分泌自身抗体的B细胞/浆细胞，存在疗效的不确定性[23,24]。

靶向清除B细胞的研究进展

近年来随着基础免疫学及技术的不断创新，细胞治疗取得明显的进展，其中最为突出的嵌合抗原受体修饰的T细胞 (CAR-T)疗法。CAR由胞外抗原结合域 (ScFV)、胞内信号传导结构及跨膜结构域组成。CAR-T是将能够抗原识别结合部和胞内信号域偶联成一个嵌合蛋白，通过基因转染进T细胞，CAR-T从而具备识别细胞表面抗原的能力[25]。随着胞内结构的不同改造，可以将CAR-T划分为4代。第一代CAR-T体内存活时间短，临床效果欠佳。第二代胞内结构加入T细胞共刺激分子CD28；第三代CAR-T在第二代的基础上再添加一个共刺激分子，比如4-1BB，CD137等；第四代CAR-T是进一步添加调节细胞因子相关的基因[26]。目前广泛应用的仍然是第二代CAR-T。机制上，CAR-T无需MHC分子限制性，直接与靶细胞高亲和力结合，杀伤靶细胞。目前最为成熟的CAR-T是治疗急性淋巴细胞白血病的CD19-CAR，在慢性淋巴细胞白血病等血液系统恶性肿瘤中有良好的临床反应。大量临床研究提示CAR-T具有良好的安全性，主要的副作用包括细胞因子释放综合征 (CRS)、脱靶效应、插入突变等；CRS，严重时可导致心力衰竭、死亡[27]。目前可通过调控CAR的结构、输注CAR-T的数量降低CRS发生率，另外可以通过糖皮质激素、IL-6受体单克隆抗体来降低CRS相关的并发症[28]。

CD19广泛的表达从前B细胞到浆细胞分化的阶段。因此，通过靶点CD19同时可以清除分泌自身抗体的B细胞/浆细胞。近期Marko Radic使用CD19-CAR T细胞治疗狼疮小鼠模型中获得成功[29-30]。使用CD8+T细胞构建CD19-CART细胞，在(NZB × NZW) F1狼疮小鼠和MRL fas/fas狼疮小鼠体内输注，发现一部分小鼠CD19+B细胞持续清除(CD19-d)，而另外一部分小鼠CD19+B细胞在三周内恢复(CD19-s)，进一步比较这两群小鼠的临床预后，发现CD19-CAR T细胞注射后，CD19-d狼疮小鼠的球蛋白水平较CD19-s狼疮小鼠明显下降，并且抗双链DNA滴度降低至无法检测的水平；其次，CD19-d狼疮小鼠临床表现明显改善，蛋白尿减少，肾脏浸润细胞、免疫复合物沉积减少；最后，B细胞过继输注于4个月前接受过CD19-CAR治疗的狼疮小鼠，发现CAR-T仍可持续清除B细胞，进一步提示CD19-CAR在狼疮小鼠中可以持久的、高效发挥效应。

这项工作的重要意义在于其不仅在哺乳类动物模型中验证了CAR-T细胞使用的安全性和可行性，还提示针对此类自身免疫性疾病，给予CD19-CAR T细胞治疗可以取得免疫学指标、组织学指标和总体生存情况的改善，为临床试验的开展提供强有力的理论和技术支持。

相比较利妥昔单抗，CD19-CAR T细胞的优势显而易见。CD19-CAR T细胞可直接清除B细胞，而利妥昔单抗需要依赖机体ADCC，CDC等作用发挥效应，因此CD19-CAR T细胞可以更高效的清除B细胞[31]；此外，临床观察发现利妥昔单抗输注3月后，存在CD20+B细胞数量反弹，而这与临床复发、治疗失败密切相关，因此利妥昔单抗治疗过程中，需定期监测B细胞数量、重复的输注，保持B细胞低水平状态。CD19-CAR在小鼠体内保持活性持续1年时间，可以长时程、持续保持B细胞耗竭的状态。此外，CD19直接参与B细胞的信号传导，促进脾脏边缘区B细胞及生发中心的B细胞的增殖、发育。CD19还表达在活化的B细胞、浆母细胞及早期的浆细胞。在SLE中，早已发现存在分泌自身抗体的表型为CD19+CD20-B细胞，利妥昔单抗只能清除外周血的B细胞，对CD20-的细胞无能为力，而CD19-CAR可以直接清除组织、外周血的分泌抗体的B细胞、浆细胞[32]。

当然使用CAR-T治疗SLE确实存在一定的风险。首先，彻底清除B细胞后存在体液免疫的缺陷，但目前SLE的治疗策略同样增加感染的风险，从CAR-T治疗血液恶性肿瘤的经验来看，CD19-CAR治疗过的肿瘤患者，仍然可以重新生成具有分泌保护性抗体的B细胞。其次，CAR-T治疗过程中可能出现的毒性及细胞因子风暴均有相对应的治疗手段。

小结:靶向耗竭B细胞的治疗策略在自身免疫病中有一定疗效。与选择传统的生物制剂相比，CAR-T技术在清除B细胞的深度、效能、持续性有着绝对的优势。基础研究和动物实验的不断深入，为实施CAR-T治疗SLE提供了理论基础及技术支持。开展CAR-T治疗SLE的临床实验，将可能为难治性重症SLE，乃至更多的自身免疫性疾病患者提供新的治疗选择，打开新的治疗局面。