TAM受体酪氨酸激酶与肾脏疾病

吕道远 综述 刘志红 审校

受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases,RTKs)是一类参与细胞信号转导的跨膜蛋白，迄今共发现58余种RTKs，可分为20个亚家族[1]。TAM(TYRO3、AXL、MER)RTKs(TAM-RTKs)是1991年发现的RTKs亚家族，由TYRO3蛋白酪氨酸激酶(TYRO3)、AXL受体酪氨酸激酶(AXL)、MER原癌基因酪氨酸激酶(MER)三成员组成，在细胞增殖、生存、迁移、胞葬、炎症及免疫调控、血小板稳定等多方面发挥重要功能。近来研究发现，TAM-RTKs参与多种肾脏疾病的发生及进展机制，本文将对其进行总结。

TAM-RTKs的结构和功能

TAM-RTKs结构和调控TAM-RTKs属单次跨膜受体，自N端至C端，分别为胞外域的2个免疫球蛋白样结构域、2个Ⅲ型纤连蛋白结构域；单次跨膜域；胞内域的1个包含KW(I/L)A(I/L)ES保守序列酪氨酸激酶域、1个免疫受体酪氨酸抑制基序结构域[2](图1)。胞内酪氨酸激酶域为其功能域，TYRO3、AXL、MER均具有各自的磷酸化和自身磷酸化位点，可通过磷酸化下游靶蛋白，发挥各自功能。TAM-RTKs主要配体为生长停滞特异性蛋白6(growth arrest specific 6,GAS6)及Protein S。二者N端均为富γ氨基谷氨酸(Gla)结构域，可在维生素K协助下依赖Ca2+与质膜上的磷脂酰丝氨酸结合，增强对TAM-RTKs的活化效应，并可被维生素K拮抗剂华法林抑制；C端为性激素结合球蛋白(SHBG)结构域，与TAM-RTKs结合。Gla与SHBG结构域间为4个表皮生长因子(EGF)样重复序列。GAS6可与TAM-RTKs三成员结合，Protein S仅可与TYRO3及MER结合[2-3](图1)。高表达的AXL可自身磷酸化活化，TAM-RTKs受体间的异源二聚化过程亦可使其不依赖于配体活化。内吞和溶酶体降解可能是AXL灭活的机制[4]。TAM-RTKs胞外域可被基质金属蛋白酶剪切释入循环，成为分泌型TAM-RTKs，参与调控TAM-RTKs功能。其中，AXL/MER的剪切位点位于其近Ⅲ型纤连蛋白结构域的胞外段，被基质金属蛋白酶ADAM10/17剪切后形成的不含激酶功能域片段的分泌型AXL/MER可与跨膜的全长TAM-RTKs竞争性结合循环中的GAS6，从而抑制TAM-RTKs的功能[5-6]。

图1 TAM-RTKs及其配体结构示意图[2]

>TAM-RTKs的功能TAM-RTKs广泛表达于肾脏固有细胞、免疫细胞、血管内皮细胞、血小板、神经细胞等，在细胞骨架与迁移、生存/凋亡与胞葬作用、炎症与免疫调控、血小板稳定等多个方面发挥重要功能：(1)细胞骨架重排：AXL通过调控PI3K/Rac/Rho通路影响细胞骨架并促进细胞迁移，MER则分别通过磷脂酶Cγ2、Scr及Vav1/Rac1/Cdc42通路参与细胞骨架重排；(2)细胞生存及程序性死亡：AXL与MER通过调控Grb2/ERK1/2及PI3K/AKT通路影响细胞增殖及生存/凋亡[7]；(3)促进“胞葬”：表达于巨噬细胞的MER及树突状细胞的TYRO3/AXL与通过Gla结构域结合于凋亡细胞膜表面磷脂酰丝氨酸的GAS6与Protein S的结合可促进吞噬细胞清除凋亡细胞(即“胞葬”)，机制涉及PI3K、磷脂酶Cγ2/PKC、Src家族激酶等的活化[8]；(4)抑制炎症：MER通过下调NF-κB信号通路抑制M1型巨噬细胞IL-12、IL-6、TNF等促炎因子的释放，增加M2型巨噬细胞IL-10、TGF-β、HGF、IL-4等抗炎因子的生成，发挥抑炎效应。在抗原提呈细胞，TLR通路活化可通过STAT1诱导AXL表达上调，后者与Ⅰ型干扰素协同上调SOCS1/3，负反馈抑制TLR活化的致炎过程[9]；(5)促进炎症和血栓形成：GAS6激活的TAM-RTKs可放大活化血管内皮细胞的促炎信号，介导VCAM-1和ICAM-1的表达。同时，在血小板及内皮细胞，TAM-RTKs磷酸化上调P选择素，后者与表达于白细胞的P选择素糖蛋白配体1结合，上述表达增加的黏附分子和P选择素可致血小板、白细胞囿于血管内皮附近；另一方面，表达于血小板表面的TAM-RTKs可通过活化PI3K/αⅡβ3 整合素增加血小板颗粒分泌及稳定性，与上述促炎及黏附机制共同促进血栓的形成[8]。

TAM-RTKs功能异常致肾脏疾病的机制

细胞增殖和转分化TAM-RTKs促进系膜细胞增殖：在体外培养的小鼠系膜细胞中，AXL同重组或系膜细胞自分泌的GAS6结合后可磷酸化激活ERK，促进细胞增殖[10]；GAS6的促肥大效应亦依赖AXL的活化[11]。Thy1(系膜增生性)肾小球肾炎小鼠肾脏增生活跃的系膜细胞中可见GAS6与AXL表达，抑制GAS6与AXL结合可抑制STAT3的磷酸化活化，减少PDGF-B产生，减轻系膜细胞增殖和细胞外基质沉积，缓解模型鼠蛋白尿[12，13]。大鼠STZ糖尿病模型肾小球系膜细胞亦存在AXL与GAS6上调，亚抗凝剂量华法林可抑制AXL上调，改善系膜细胞及肾小球肥大，降低估算的肾小球滤过率(eGFR)及尿白蛋白排泄率[11]。体外实验显示，高糖刺激小鼠系膜细胞肥大依赖GAS6-AXL活化后AKT、p70 S6K的磷酸化及4E-BP-1的合成，使用PI3K通路抑制剂LY294002或mTOR抑制剂雷帕霉素均可抑制GAS6介导的系膜细胞肥大。敲除GAS6亦可减轻早期糖尿病肾脏病变小鼠肾脏AKT及4E-BP-1的磷酸化活化，减轻系膜细胞增殖和肾小球肥大[14]。上述结果显示GAS6-AXL通过活化AKT/mTOR通路参与糖尿病肾脏系膜细胞增殖及肾小球病变。TAM-RTKs不同成员对肾脏细胞表型影响各异，敲除MER的抗GBM肾炎小鼠模型中，肾脏PCNA阳性细胞数增加，肾脏病变加重；而敲除AXL则致肾脏PCNA阳性细胞数减少，肾脏病变减轻[15]。GAS6-AXL亦参与肾小管对滤过屏障受损所致白蛋白尿的适应性增生反应中：在选择性足细胞删除致白蛋白尿的小鼠模型中可见肾小管顶端及基底部的AXL磷酸化活化，提示TAM-RTKs可能参与肾小管功能的维系或代偿[16]。

TAM-RTKs促进肾组织上皮-间充质转分化(EMT)：在小鼠单侧输尿管梗阻(UUO)模型中，AXL特异性抑制剂Bemcentinib可减轻肾组织纤维化，抑制随AXL上调的间充质标记蛋白α-SMA及波形蛋白并下调EMT调控基因SNAI1/2、TWIST及STAT1的表达。Bemcentinib亦可减弱建模“打击”对正常肾脏70个EMT相关基因改变程度的影响[17]，提示AXL可能通过EMT推动肾脏纤维化。

细胞生存/凋亡国家肾脏疾病临床医学研究中心在体外培养的人足细胞中敲低TYRO3后见其凋亡增加，并加重高糖诱导的足细胞凋亡，而加入Protein S激活TYRO3后高糖诱导的足细胞凋亡减轻，且激活TYRO3对高糖刺激下足细胞的保护效应可被AKT特异性抑制剂抑制[18]，提示TYRO3在足细胞中通过AKT信号通路发挥抗凋亡效应，保护高糖对肾脏滤过屏障的损伤。在慢性肾脏病(CKD)合并高磷血症小鼠模型中，敲除AXL见肾小管间质凋亡细胞数目增多，伴氮质血症加重，死亡率增高[19]，表明表达于肾小管间质细胞中AXL的抗凋亡效应可能在CKD中发挥保护效应。肾毒性血清(NTS)肾炎小鼠敲除MER亦见肾小球及小管凋亡细胞数显著增多，肾脏病变加重[20]，提示MER具有抗凋亡保护效应。

TAM-RTKs促生存及抗凋亡作用对肾脏的保护效应尚有争议，Zhen等[15]发现虽然敲除NTS肾炎小鼠AXL能抑制肾脏AKT及其磷酸化活化，上调生存相关蛋白Bcl-xL并改善肾脏功能，但并不显著影响凋亡相关蛋白Caspase-1及Caspase-3的表达。因肾脏固有细胞、浸润细胞生存及凋亡过程在各类肾脏疾病中的作用和影响各异，TAM-RTKs的作用机制仍需深入研究。

炎症GAS6/AXL在IgA肾病、狼疮性肾炎(LN)、抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关肾小球肾炎，肾移植急性排斥等疾病的肾小球、肾小管或血管中膜中呈现非特异性显著上调[21]，提示TAM-RTKs参与肾脏炎症。TAM-RTKs对肾脏炎症的调控效应可能具有双面性，MER敲除的NTS肾炎小鼠模型异源期肾小球多形核白细胞多于野生型小鼠，炎症因子MCP-1、IL-1上调，同源期MCP-1、TNF-α及IL-6上调[20]，提示MER在NTS肾炎肾脏炎症起始及持续过程中均发挥抗炎保护效应。在体外比较MER敲除小鼠与野生小鼠肾脏内皮细胞经LPS刺激后炎症相关信号通路的变化，可见前者NF-κB p65亚基及其磷酸化水平均更高。蛋白芯片结果显示，LPS刺激MER敲除小鼠的肾脏内皮细胞趋化及细胞因子CXCL-1、M-CSF及IL-6上调更为显著[22]。国家肾脏疾病临床医学研究中心发现TAM-RTKs参与糖尿病肾病(DN)病情进展：在体外培养的人足细胞中，DN进展过程中关键炎症通路TNF-α/NF-κB活化可抑制TYRO3的表达，而TYRO3降低或缺失在斑马鱼或DN模型小鼠中均导致足细胞滤过屏障功能受损[18]。与MER及TYRO3不同，AXL具有促进肾脏炎症及病情进展的效应：在抗GBM肾炎小鼠模型中，敲除AXL或Bemcentinib干预均可见尿素氮下降、肾小球/小管蛋白管型减轻等保护效应，且抑制AXL可降低肾脏淋巴细胞趋化和活化因子SDF-1与中性粒细胞趋化和活化因子IL-8表达[23]。敲除建模8d的NTS肾炎小鼠AXL可见IL-6表达下调及干扰素γ的下调趋势，与模型鼠较轻的氮质血症和较高的生存率相符[15]。使用Bemcentinib抑制UUO小鼠模型肾脏中上调的AXL亦见细胞因子MCP-1、MCP-3、MCP-5及TARC下调，伴巨噬细胞标记物下调，炎性浸润减轻等表现[17]。

肾外的TAM-RTKs亦可通过调控机体炎症状态进而影响肾脏，将AXL表达或敲除的骨髓起源巨噬细胞分别注射给抗GBM肾炎小鼠可见AXL敲除巨噬细胞受鼠血IL-6及血清肌酐均高于AXL表达巨噬细胞受鼠，尿蛋白亦见相似趋势，提示AXL敲除巨噬细胞分泌的IL-6可能推动抗GBM肾炎病情进展[24]。在醋酸脱氧皮质酮诱导的盐型高血压小鼠模型中，造血细胞AXL敲除的野生嵌合鼠较野生型、AXL全身敲除及仅造血细胞表达AXL的全身敲除嵌合鼠尿蛋白为最低，肾脏干扰素γ、IL-3、CD40配体、C3等炎症及免疫相关基因表达下调，表明造血细胞表达的AXL可调控肾脏炎症及免疫过程，对高血压肾损伤具有保护效应，表现为总白细胞、B细胞及树突状细胞数增加，巨噬细胞数减少，肾脏炎症减轻，尿蛋白水平降低[25]。

氧化应激氧化应激与炎症密切相关，在缺血再灌注AKI大鼠模型可见肾脏GAS6及AXL下调，伴氧化应激/炎症信号通路NF-κB活化，下游氧化应激/炎症蛋白MCP-1、环氧合酶-2、iNOS、12-脂氧合酶、NAD(P)H氧化酶Rac1、p47phox、p67phox、gp91phox亚基上调；抗氧化/炎症信号通路Nrf2及下游功能蛋白HO-1、过氧化氢酶、GCLC、NQO-1下调。给予褪黑素或茯苓酸A可上调GAS6-AXL，恢复功能异常的NF-κB及Nrf2信号通路，改善肾功能及肾脏氧化应激/炎症状况。体外敲低大鼠近端小管上皮细胞AXL可见MCP-1、环氧合酶2上调，HO-1、NQO-1下调，缺氧/复氧损伤下调GAS6-AXL，活化NF-κB并抑制Nrf2信号通路及各自下游氧化应激/炎症相关蛋白，褪黑素或茯苓酸A亦可抑制上述改变[26]。上述结果提示GAS6-AXL通过NF-κB/Nrf2信号通路调控AKI肾脏氧化应激/炎症状态，或成为AKI干预的新靶点。

免疫调控Lee等[27]在CKD血液透析(HD)患者血液CD14intCD16+单核细胞亚群中发现MER较健康人表达下降，提示循环中单核细胞MER表达异常可能与CKD机体免疫紊乱或炎症反应相关。在使用淋巴细胞缺陷小鼠(Rag1-/-)建立的高血压肾损伤模型中，敲除固有免疫细胞AXL可降低血压，减轻肾髓质中免疫细胞集聚和水盐潴留等早期高血压肾脏病变表现，全身敲除Rag1-/-高血压肾损伤小鼠AXL亦见肾髓质中髓样细胞累积减少，伴肾脏盐排泄及肾血管数增加，液体负荷减轻[28]。TAM-RTKs亦参与肾小管疾病的免疫调控，对UUO小鼠肾脏mRNA测序结果的基因本体分析显示，Bemcentinib抑制AXL可下调淋巴细胞与白细胞活化相关基因、免疫系统发育、免疫流程及免疫反应调控相关基因的表达[17]。

TAM-RTKs致肾脏疾病的机制总结见表1。

TAM-RTKs与肾脏疾病

TAM-RTKs在肾脏疾病临床诊疗中具有重要价值，分泌型TAM-RTKs受包括肾脏在内的机体多系统配体依赖的TAM-RTKs活化的影响，可与肾脏TAM-RTKs共同反映肾脏病变程度。Li等[29]比较了29例LN及10例原发性肾病综合征患者肾脏MER与AXL表达水平，发现LN患者肾内MER与AXL表达上调，且MER表达水平与血液中IgG、IgA及抗ds-DNA抗体滴度呈正相关，与C3及C4水平负相关；肾内IgA、IgM沉积多的LN患者MER及AXL表达均更高，IgG、C1q沉积多的患者AXL表达更高，MER亦与肾内C3沉积呈正相关。此外，15名LN继发肾病综合征患者MER与AXL均高于原发肾病综合征患者，提示肾脏TAM-RTKs异常升高与LN免疫失稳态存在关联，可能参与LN的发生及进展。活动性LN患者血液分泌型AXL与GAS6均高于无肾炎SLE患者，SLE-DAI≥10的活动性SLE患者血液分泌型AXL亦高于非活动者，且与24h尿蛋白排泄率呈正相关[30-31]。亦有研究发现，LN患者血液分泌型MER高于SLE无肾炎者，且与血液中C1q呈负相关[32]。

在DN等CKD患者亦可见循环分泌型TAM-RTKs与病情的关联。Ochodnicky等[33]发现DN患者血液中分泌型TYRO3、AXL、MER均高于健康人，且分泌型MER同时高于正常白蛋白尿2型糖尿病(T2DM)患者。在T2DM患者中，血液中分泌型MER与尿白蛋白排泄率及eGFR呈正相关。DN患者尿液中分泌型MER、TYRO3均高于正常白蛋白尿T2DM患者，T2DM患者尿液分泌型MER、TYRO3与尿白蛋白排泄率呈正相关，Logistic回归显示尿分泌型MER、TYRO3升高是发生DN的危险因素，DN患者肾小管MER与TYRO3表达下降。与健康人群相比，CKD与维持性HD患者血液分泌型MER、AXL均升高，在HD患者中，分泌型AXL与血肌酐呈正相关，与eGFR呈负相关。分泌型MER、AXL随CKD进展呈上升趋势，随访发现分泌型MER较高的HD患者5年生存率较低[27]。

表1 TAM受体酪氨酸激酶(TAM-RTKs)致肾脏疾病机制

GN：肾小球肾炎；DN：糖尿病肾病；UUO：单侧输尿管梗阻；NTS：肾毒性血清；AKI：急性肾损伤；STAT3：信号传导与转录激活因子3；PDGF-B：血小板源性生长因子B；p42/44 MAPK：p42/44丝裂原活化蛋白激酶；p-p42/44 MAPK：磷酸化p42/44丝裂原活化蛋白激酶；AKT：蛋白激酶B；p-AKT：磷酸化蛋白激酶B；p70 S6K：p70核糖体蛋白S6激酶；p-p70 S6K：磷酸化p70核糖体蛋白S6激酶；4E-BP-1：真核翻译起始因子4E结合蛋白1；p-4E-BP-1：磷酸化真核翻译起始因子4E结合蛋白1；p27：细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1B；PCNA：增殖细胞核抗原；α-SMA：α平滑肌肌动蛋白；SNAI1/2：Snail家族锌指蛋白1/2；TWIST：Twist家族BHLH转录因子1；STAT1：信号传导与转录激活因子1；Bcl-xL：B细胞淋巴瘤因子2样蛋白1；MCP-1：单核细胞趋化蛋白1；TNF-α：肿瘤坏死因子α；IL-1：白细胞介素1；IL-3：白细胞介素3；IL-6：白细胞介素6；IL-8：白细胞介素8；NF-κB：核因子κB；SDF-1：基质细胞衍生因子1；MCP-3：单核细胞趋化蛋白3；MCP-5：单核细胞趋化蛋白5；TARC：胸腺和活化调节趋化因子；C3：补体C3；iNOS：诱导型一氧化氮合酶；Rac1：Ras相关C3肉毒毒素底物1；p47phox：中性粒细胞胞质因子1；p67phox：中性粒细胞胞质因子2；gp91phox：NADPH氧化酶2；Nrf2：转录因子NF-E2相关因子2；HO-1：血红素加氧酶1；GCLC：谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基；NQO-1：NAD(P)H醌氧化还原酶1

循环中分泌型TAM-RTKs的来源目前尚不明确。Lee等[27]在HD患者单核细胞中发现MER下调，且将MER切割释入循环的ADAM17上调，提示免疫细胞TAM-RTKs可能是CKD患者血液中分泌型TAM-RTKs升高的来源之一。

TAM-RTKs亦参与肾脏疾病血管病变的发生和发展。AXL通过影响细胞生存及迁移表型参与尿毒症毒素致血管平滑肌细胞异常增生导致的粥样硬化过程[34]。GAS6/AXL还参与到CKD高磷血症致血管钙化的过程中，目前认为GAS6/AXL功能不足致血管平滑肌细胞凋亡增加可能是高磷致血管钙化的机制之一[35]。

结 语

TAM-RTKs的多种功能及其对肾脏细胞增殖、转分化、生存、凋亡、炎症、氧化应激、免疫反应的多种效应决定了其功能异常对肾脏疾病影响的复杂性及多样性。肾脏TAM-RTKs及循环中分泌型TAM-RTKs与临床肾脏疾病的关联展现了其作为肾脏疾病诊治标记物的潜力。随着TAM-RTKs特异性小分子抑制剂和分泌型TAM-RTKs检测手段的不断成熟，TAM-RTKs的靶向干预有望成为未来肾脏疾病诊治的新思路之一。