Notch通路上调miR−223抑制FBXW7表达对结肠癌HCT116细胞生物学的影响

刘志新，段菊凤，马藤，杨靖，谭华炳，刘龙△

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是第三大常见的恶性肿瘤，死亡率在所有恶性肿瘤中居第4位[1−2］。F−box家族的FBXW7是一个新发现的癌症抑制基因，其异常表达与结直肠癌、胃癌和卵巢癌等有关，常常扮演抑癌基因的角色，影响肿瘤细胞增殖、凋亡和信号转导等过程[3−4］。近年的研究表明，FBXW7基因的表达在CRC发生、发展和转移中发挥了不可或缺的作用[5−6］。MicroRNAs（miRNAs）是一种非编码小RNA分子，通过部分同源序列结合到mRNA的3′非翻译区（3′UTR），并引起mRNA降解或蛋白质翻译抑制，从而调控目的基因表达[7］。然而，目前miR−223抑制FBXW7mRNA，从而影响结肠癌细胞增殖与凋亡的分子机制尚不明确。本研究旨在探讨miR−223调控FBXW7基因表达，进而影响结肠癌HCT116细胞活性和凋亡的机制，以期为临床相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选取2016年10月—2018年1月于十堰市人民医院就诊并存于病理科的20例结肠癌组织及癌旁正常组织标本，包括TNMⅢ期和Ⅳ期肿瘤组织。人结肠癌HCT116细胞由湖北医药学院基础医学院分子免疫学实验室保存。DMEM培养液、高糖DMEM培养基购自Thermo公司，胎牛血清（FBS）、Opti−MEM培养液购自Gibco公司，LipofectMINETM2000购自美国Invitrogen公司，TRIzol购自宝生物工程（大连）有限公司，反转录试剂和实时荧光定量PCR试剂盒均购自ABM公司，PCR引物购自苏州金维智公司，microRNAs购自上海生工生物工程有限公司，BCA蛋白定量试剂盒和ECL均购自碧云天生物技术研究所，CCK−8试剂购自日本同仁化学研究所，PVDF膜均购自美国Millipore公司，Annexin V−FITC/碘化丙啶（PI）细胞凋亡检测试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司，荧光检测试剂盒Luciferase Assay System购自Promega公司。鼠抗人FBXW7多克隆抗体、鼠抗GAPDH单克隆抗体、羊抗鼠IgG（二抗）购自碧云天生物技术研究所。

1.2 标本检测

1.2.1 临床标本定量PCR检测 将结肠癌组织和癌旁组织标本匀浆后采用TRIzol提取总RNA，采用反转录试剂盒以oligo（dT）引物得到细胞cDNA，定量PCR检测细胞中FBXW7和MiR-223的表达水平。引物序列见表1，反应过程：95℃30 s；40个循环：95℃5 s，60℃30 s。实验进行3次，数据采用2−ΔΔCt法进行分析。

1.2.2 Western blot检测标本FBXW7表达 结肠癌组织和癌旁组织标本蛋白通过10% SDS−PAGE胶分离，电转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭，加入鼠抗人FBXW7多克隆抗体（1∶2 000稀释）及鼠抗人GAPDH单克隆抗体（1∶5 000稀释），4℃孵育过夜，洗膜3次后加入羊抗鼠IgG（1∶5 000稀释），室温孵育1 h后行ECL显影。3次重复，GAPDH作为内参，采用Image Lab对蛋白条带灰度值进行半定量分析。

Tab.1 The nucleotide sequences used in q-PCR of this study表1 定量PCR所用引物序列

1.3 microRNAs挖掘验证

1.3.1 microRNAs挖掘 为了进一步挖掘调控FBXW7基因表达的microRNAs，将人源FBXW7序列提交到生物信息学网站TargetScan，预测作用于FBXW7基因的所有microRNAs序列和位点。

1.3.2 microRNAs特异扩增 以颈环引物逆转录得到预测microRNAs的cDNA，采用实时荧光定量PCR检测细胞中microRNAs的mRNA水平。引物序列见表1，程序同1.2.1，实验进行3次。

1.3.3 荧光素酶实验验证microRNAs与FBXW7结合 构建pMIR−miR−223、pMIR−miR−25质粒，miR−223模拟物（miR−223 mimics）与miR−223抑制剂（Inhibitor）作为对照，4组分别与pRL−TK质粒共转染入人胚肾HEK−293T细胞。36 h后采用荧光检测试剂盒Luciferase Assay System测定细胞荧光素酶的表达活性。将平皿中的细胞用5×细胞裂解试剂（Promega）裂解，离心后收集上清液加入100µL荧光素酶测定试剂室温混合，使用Glomax 20/20生物与化学发光检测仪（Promega）测定荧光素酶活性。

1.4 鉴定miR−223影响FBXW7表达及细胞生物学功能实验

1.4.1 检测HCT116细胞FBXW7 mRNA和蛋白表达量 转染miR−223与对照（miCtr）、miR−223抑制剂（Inhibitor）进入HCT116细胞，收集转染48 h后的各组细胞总蛋白并通过Western blot检测FBXW7表达量，进行3次生物学重复，对蛋白条带进行灰度分析。提取3组细胞总RNA，通过定量PCR检测各组miR−223和FBXW7的mRNA水平，方法同1.2.1。

1.4.2 细胞活性及凋亡检测 采用CCK−8法检测HCT116细胞活性，分组同1.4.1。将转染12、24、48、72 h后的各组HCT116细胞分别加入CCK−8试剂（10µL/孔），放入培养箱中继续培养2 h，用酶联免疫检测仪检测450 nm波长处各孔的光密度（OD）值。每组设生物学重复3次。收集转染48 h后 的 各 组HCT116细 胞，用PBS洗 涤2次，加 入500µL Binding Buffer悬浮细胞，加入5µL Annexin V−FITC混匀，最后加入5µL PI混匀，室温避光孵育10 min。通过流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。进行3次生物学重复。

1.5 Notch通路影响miR−223及细胞生物学功能鉴定

1.5.1 Notch通路调控miR−223表达鉴定 将siNotch3和对照NC、Ctr分别转染HCT116细胞，转染48 h后分别提取3组细胞总RNA，通过定量PCR检测miR−223及FBXW7的mRNA水平，方法同1.2.1。

1.5.2 Notch通路影响HCT 116细胞凋亡 分组同1.5.1，转染48 h后应用Annexin V−FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒染色，并用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡水平。方法同1.4.2。

1.6 统计学方法 采用GraphPad Prism 5.0软件进行作图，采用SPSS 18.0进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，2组间比较用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD−t检验。重复测量设计的计量资料比较采用重复测量资料方差分析，每个时点多组间比较使用Bonferroni法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌组织中FBXW7 mRNA与蛋白表达量下调FBXW7在结肠肿瘤组织中的mRNA含量较癌旁组织显著降低（1.42±0.12vs.1.95±0.13；n=20，t=13.141，P＜0.001）；FBXW7蛋白表达量也低于癌旁组织（0.42±0.05vs.1.04±0.07；n=3，t=12.966，P＜0.05），见图1。

Fig.1 The FBXW7 expression levels in CRC tissue and normal tissue图1 结肠癌组织和正常组织中FBXW7蛋白表达

2.2 挖掘与FBXW7序列结合的microRNAs 经过生物信息学网站TargetScan预测，作用于人源FBXW7基因的microRNAs包含以下作用位点和序列信息，共4条保守序列和2条非保守序列，见表2。

2.3 结肠癌细胞中microRNAs含量 经生物信息学预测得到的miR−223、miR−25、miR−32和miR−22都实现了高特异性扩增，miR−223和miR−25在Ct＜30区域即检测到特异性扩增，miR−32在Ct＜35区域得到特异性扩增，见图2。癌旁组织样本中miR−223的mRNA水平低于结肠癌组织（1.14±0.37vs.4.20±0.53；n=20，t=20.955，P＜0.001）。

Fig.2 Amplification efficiency of four miRNAs in HCT116 cells图2 结肠癌细胞株HCT116中4种miRNAs的扩增效率

2.4 miR−223与靶基因FBXW7有结合作用 miR−223 mimics组、pMIR−miR−223组、pMIR−miR−25组及Inhibitor组的荧光值分别为1.02±0.07、0.53±0.05、1.48±0.13及0.78±0.07（n=3，F=67.624，P＜0.001），过表达miR−223与miR−25可显著降低萤光素酶的活性（P＜0.01）。

2.5 HCT116中miR−223抑制抑癌基因FBXW7的表达 miR−223组FBXW7 mRNA和蛋白相对表达水平 较miCtr组 与Inhibitor组均下降（P＜0.01），见表3。

2.6 miR−223抑制抑癌基因FBXW7影响结直肠癌细胞活性和凋亡 miR−223与Inhibitor处理HCT116细胞活性有影响且与时间存在交互效应（P＜0.05），见表4。miCtr组、Inhibitor组及miR−223组HCT116细胞凋亡率分别为5.55±0.57、3.64±0.55和9.35±0.55（单位：%；n=3，F=80.913，P＜0.001），其中miR−223组较前2组显著降低（P＜0.01）。

Tab.2 miRNAs binding positions in FBXW7 predicted by TargetScan表2 TargetScan预测人源FBXW7基因的miRNAs结合位点

Tab.3 Changes of miR-223,FBXW7 mRNA and protein levels affected by miR-223表3 miR-223影响miR-223与FBXW7 mRNA及蛋白含量变化 （n=3，±s）

Tab.3 Changes of miR-223,FBXW7 mRNA and protein levels affected by miR-223表3 miR-223影响miR-223与FBXW7 mRNA及蛋白含量变化 （n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与miCtr组 比 较，b与Inhibitor组比较，P＜0.05

组别miCtr组Inhibitor组miR−223组F miR−223 mRNA 0.96±0.05 0.71±0.21 2.70±1.08ab 8.693＊FBXW7 mRNA 1.01±0.04 1.05±0.09 0.61±0.09ab 29.744＊＊FBXW7蛋白0.97±0.01 1.37±0.04 0.48±0.03ab 674.215＊＊

Tab.4 Cell viability in HCT116 cells affected by miR-223 and inhibitor表4 miR-223与Inhibitor处理对HCT116细胞活性的影响（n=3，OD值，x ±s）

2.7 Notch通路影响miR−223表达及HCT116细胞凋亡 siNotch3组miR−223 mRNA相对表达量较NC组和Ctr组均减低（P＜0.001），而FBXW7mRNA表达量升高（P＜0.01）。相对于NC组，siNotch3组细胞凋亡率显著下降（P＜0.05），见表5。

Tab.5 The effect of siRNA on Notch pathway表5 siRNA干扰Notch通路的影响 （n=3，±s）

Tab.5 The effect of siRNA on Notch pathway表5 siRNA干扰Notch通路的影响 （n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与NC组比较，b与Ctr组比较，P＜0.05

组别NC组Ctr组siNotch3组F miR−223 mRNA 1.09±0.11 1.05±0.03 0.25±0.07ab 112.832＊＊FBXW7 mRNA 1.05±0.08 0.94±0.05 9.92±4.16ab 13.790＊＊凋亡率（%）5.70±1.03 4.64±1.20 2.83±0.62ab 6.560＊

3 讨论

抑癌基因FBXW7通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡而发挥其抑制肿瘤的功能［8−9］。FBXW7是影响结直肠癌患者生存期的独立因子，且其表达与结直肠癌发生、发展及预后有一定关系［10］。miR−223与胃癌患者肿瘤大小、TNM分期明显有关，也与大肠癌侵袭及远处转移有关，可能在大肠癌的发生发展中发挥一定作用［11］，但其机制仍旧未知。

FBXW7是多种miRNAs的靶标之一，相关研究证实，miR−25和miR−223可降低FBXW7的mRNA水平，并且miR−223可调节FBXW7的表达，从而调控细胞周期蛋白E的活性，最终影响细胞周期进程［12］。本研究结果显示，转染miR−223后结肠癌细胞HCT116中FBXW7的mRNA水平和蛋白表达量均显著下调，同时细胞活性增加、细胞凋亡数量减少，这与miR−200a和miR−125b在结直肠癌细胞中的作用一致［13−14］。同时证实，miR−223可以抑制FBXW7的mRNA和蛋白含量，而抑制miR−223不影响HCT116细胞活性，但细胞凋亡率升高，考虑可能是由于Inhibitor仅抑制微量的内源性miR−223，不足以影响FBXW7调控细胞周期蛋白E的活性，但可以通过其他途径影响细胞凋亡所致，此有待进一步研究。

多项研究证实，抑制Notch−1活性可影响细胞转移、侵袭与生长［15−16］，而在非小细胞肺癌中，阻断Akt或Notch信号通路可减少miR−223的表达［17］。本研究通过siRNA干扰Notch通路影响HCT116细胞miR−223及FBXW7的表达，细胞凋亡率降低，表明Notch通路上调miR−223表达而抑制细胞凋亡。过表达miR−223而下调FBXW7可能参与一些癌症的发生发展［18］，因此miR−223表达失调可能在细胞转化中损害FBXW7的肿瘤抑制活性。这提示Notch/miR−223/FBXW7途径有望成为临床上结直肠癌治疗潜在的生物标志，并可能作为潜在的药物作用靶标。

综上所述，Notch通路上调miR−223而抑制FBXW7的表达，最终促进结直肠癌HCT116细胞增殖而抑制其凋亡。