SIRT1 对H2O2 诱导的人卵巢颗粒细胞氧化应激损伤的影响

和 斌，李祺越，洪 岭，伍园园，滕晓明，唐传玲

同济大学附属第一妇婴保健院辅助生殖医学科，上海 201204

卵泡是女性的基本生殖单位。在卵泡微环境中，颗粒细胞紧密包裹在卵母细胞外，为卵母细胞发育提供营养和促成熟因子，两者的交互“对话”对卵母细胞的分化发育与成熟起着举足轻重的作用[1]。颗粒细胞数量减少、功能受损、细胞间联系中断，可诱发卵母细胞凋亡，导致卵巢功能下降[2]。体内外各种刺激可诱发卵泡微环境产生活性氧簇物质（reactive oxygen species，ROS）。正常情况下，颗粒细胞可通过自身的抗氧化系统保护卵母细胞免受氧化应激损伤[3]；然而，在体外受精治疗过程中，颗粒细胞ROS 异常增加可引起氧化应激损伤，进一步影响卵子、胚胎质量以及临床妊娠结局[4-5]。因此，保护颗粒细胞免受氧化损伤对于维持和提高女性的生育能力具有重要意义。

沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1）是脱乙酰酶Sirtuin 家族中研究最深入的一个成员。其通过对多种非组蛋白及组蛋白赖氨酸残基进行去乙酰化修饰来调节基因表达，参与细胞衰老、糖脂代谢、氧化应激、炎症、细胞凋亡等生理活动[6]，也是细胞抵抗氧化应激损伤的重要分子[7]。近年来，很多研究发现SIRT1在调节卵巢功能方面也发挥重要作用，可以促进高脂饮食肥胖小鼠的卵泡存活[8-9]。此外，SIRT1 具有促进人卵巢颗粒细胞的增殖以及维护颗粒细胞稳态的作用[10]，但目前有关SIRT1 在颗粒细胞氧化损伤中作用的研究并不多见。H2O2作为ROS 的主要成员，极易透过细胞膜，可用于模拟体内的氧自由基损伤，而且性质相对稳定，易于获得，已成为研究细胞氧化应激损伤的常用工具。本研究用H2O2处理SVOG 细胞（非肿瘤源性的永生化人卵巢颗粒细胞系），建立人卵巢颗粒细胞体外氧化应激模型，测定有关氧化应激相关指标，并分析衔接蛋白P66SHC（the 66 kDa Src homology 2 domain containing isoform）与B 淋巴细胞瘤-2因子（B-cell lymphoma-2，BCL-2）等氧化应激有关分子的表达情况，探讨SIRT1 在H2O2诱导的SVOG 细胞氧化应激损伤中的作用及可能机制，以期为保护颗粒细胞免于氧化应激损伤、维持卵泡正常发育提供新的对策。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

胎牛血清购自以色列Biological Industries 公司，DMEM/F12 培养基购自美国Hyclone 公司，丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量检测试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性检测试剂盒、实时荧光定量PCR（qPCR）试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，CCK8 试剂盒购自苏州新赛美生物科技有限公司，反转录试剂盒购自日本TaKaRa 公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG 抗体、兔抗人SIRT1、P66SHC、BCL-2、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗体均购自美国ProteinTech 公司，4,6-二氨基-2-苯基吲哚（4，6-diamino-2-phenyl indole，DAPI） 购 自 美 国Sigma 公司，增强化学发光法（ECL）试剂购自美国Millipore 公司，Opti-MEM 培养基购自美国Gibco 公司，转染试剂盒Lipofectamine®3000 购自美国ThermoFisher 公司。ABI StepOne Q-PCR 仪器购自美国ThermoFisher 公司，BX51荧光显微镜和DP70 数字成像系统购自日本Olympus 公司，Spectramax M5 酶标仪购自美国Molecular Devices 公司。SIRT1 过表达质粒pcDNA3.1-SIRT1 委托江苏知萌生物医药科技有限公司构建，所有引物均由上海生工生物有限公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 SVOG 细胞购自上海泽叶生物科技有限公司，使用含有10%血清的DMEM/F12 培养基，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。本研究所有实验经同济大学附属第一妇婴保健院伦理委员会批准。SOVG 细胞根据实验需要被分为空白对照组（对照组）、H2O2处理组（H2O2组）、SIRT1 过表达质粒转染组（SIRT1 组）和SIRT1 过表达质粒转染后H2O2处理组（SIRT1+H2O2组）。

1.2.2 细胞转染SIRT1 过表达质粒 将SVOG 细胞按5×105/mL 接种到6 孔板中，待细胞生长融合至约80%时换液行SIRT1 过表达质粒转染。一个无菌EP 管中加入3.75 μL Lipofectamine®3000 试剂，用125 μL Opti-MEM 培养基稀释，并充分混匀；在另一个无菌EP 管中将1.5 μg质粒稀释于125 μL Opti-MEM 培养基，然后添加P3000TM试剂5 μL，充分混匀。将上述2 个EP 管中液体按1:1 比例混匀，室温孵育10 min 后，加至6 孔板中，250 μL/孔，放置于培养箱中继续培养48 h 后，qPCR 和Western blotting 检测SIRT1 过表达情况。

1.2.3 细胞氧化应激模型 参照文献[11-12]采用H2O2建立细胞氧化损伤模型，使用不同浓度H2O2（0、100、250、500、1 000 μmol/L） 处 理SVOG 细 胞， 分 别 于4、8、12、24 h 后，通过细胞核形态，细胞活力等数据，选取细胞核形态和活力具有显著性变化，且细胞存活率处于50%～70%的最低浓度和合适时间作为后续诱导氧化损伤模型的条件。

1.2.4 CCK8 法检测细胞活力 为了观察H2O2处理对人卵巢颗粒细胞活力的影响，使用CCK8 试剂盒进行细胞活力检测。将SVOG 细胞按1×104/100 µL 接种到96 孔板中，待细胞融合至约80%后，加入含有不同浓度H2O2的培养基，分别于4、8、12、24 h 后，每孔加入CCK8 试剂10 μL，继续培养1 h，酶标仪测定450 nm 处吸光度值[D（450 nm） ]， 计 算 细 胞 活 力=[D （450 nm）加药-D （450 nm）空白]/ [D （450 nm）未加药-D （450 nm）空白]×100%。

1.2.5 荧光显微镜观察细胞核形态 将培养皿中的细胞，PBS 浸洗3 次，加入DAPI，室温避光孵育5 min，PBS 洗涤后在荧光显微镜下观察细胞核形态。

1.2.6 氧化应激指标检测 MDA 和SOD 是反映氧化应激状态的常用指标。MDA 是胞膜脂质过氧化终产物，可间接反映细胞受自由基攻击所受的损害，而SOD 是机体内清除自由基的重要抗氧化酶。收集不同处理组细胞的裂解液，检测MDA 含量和SOD 活性，实验均严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.7 qPCR 检测 收集细胞样品，加入TRIzol 提取细胞RNA，采用反转录试剂盒合成cDNA。以cDNA 为模板，按照qPCR 试剂盒说明书检测SIRT1、P66SHC、BCL-2、β 肌动蛋白（β-actin）的mRNA 水平。每个样本设置3 个复孔，实验重复3 次。各待测基因引物序列见表1。

表1 qPCR 引物序列Tab 1 Primers used for qPCR

1.2.8 Western blotting 检测蛋白水平 收集细胞裂解液，离心后吸取上清液，蛋白定量。配制10%分离胶及5%浓缩胶，蛋白上样，70 V 电泳30 min，125 V 电泳70 min，300 mA 转膜120 min。室温下封闭2 h，分别加入兔抗人SIRT1、P66SHC、BCL-2、GAPDH 多克隆抗体（1:1 000稀释），4 ℃摇床孵育过夜，充分洗涤后，加入HRP 标记的羊抗兔IgG 抗体（1:5 000 稀释）室温孵育1 h，充分洗涤后，加入ECL 发光液，曝光，经数码凝胶图像处理系统扫描图像。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism 7.0 软件进行统计分析，数据均以±s 表示，2 组间比较使用独立样本t 检验，多组间比较采用单因素方差分析结合Tukey 检验。所有实验重复3次，以P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 H2O2 处理诱导SVOG 细胞氧化应激损伤

采用H2O2处理SVOG 细胞诱导颗粒细胞体外氧化应激损伤模型。CCK-8 细胞活力实验结果（图1A）显示，随着H2O2浓度及处理时间的增加，SVOG 细胞的活力逐渐下降。250 μmol/L H2O2处理12 h，SVOG 细胞的活力下降至对照组的60%左右，差异有统计学意义（P=0.017）。荧光显微镜观察结果（图1B）显示，250 μmol/L H2O2处理12 h，SVOG 细胞的细胞核明显缩小，染色质凝集呈颗粒团块状分布，表明颗粒细胞发生凋亡；同时检测氧化应激相关分子，结果（图1C、D）显示，MDA 含量升高（P=0.001），SOD 活性下降（P=0.006），进一步证实250 μmol/L H2O2处理SVOG 细胞12 h 可诱导颗粒细胞体外氧化应激损伤，因此选择该H2O2浓度和处理时间用于后续实验。

2.2 氧 化 应 激 状 态 下SVOG 细 胞SIRT1、P66SHC 与BCL-2 的表达水平

H2O2处 理SVOG 细 胞 后，qPCR 结 果（图2A、B、C）显示，SVOG 细胞经H2O2处理后，SIRT1 及BCL-2 的mRNA 水平与对照组相比明显下降，P66SHC 明显升高，差异均有统计学意义（均P<0.05）。Western blotting 结果（图2D）进一步证实H2O2处理后，SVOG 细胞SIRT1 表达下降，P66SHC 表达升高，BCL-2 表达下降。表明H2O2诱导的SVOG 细胞氧化损伤伴随着SIRT1、BCL-2 的表达水平下降及P66SHC 的表达升高。

2.3 SVOG 细胞转染SIRT1 过表达质粒后P66SHC 及BCL-2 的表达

通过脂质体转染SIRT1 过表达质粒，转染48 h 后收集细胞进行检测。qPCR（图3A、B、C）结果显示，SIRT1组与对照组相比，SIRT1 及BCL-2 的mRNA 水平均升高（均P<0.05），而P66SHC 的mRNA 水平下降（P=0.000）；Western blotting 结果与qPCR 的结果一致（图3D）。

2.4 SIRT1 过表达对H2O2 诱导的SVOG 细胞氧化应激损伤的影响

SVOG 细胞转染SIRT1 过表达质粒及H2O2处理后与H2O2组相比（图4），细胞核形态正常，呈圆形或椭圆形，荧光分布均匀；MDA 含量下降（P=0.038），SOD 活性升高（P=0.021）。这些结果提示上调SIRT1 表达可减轻H2O2诱导的SVOG 细胞氧化应激损伤。

图1 H2O2 处理诱导的人卵巢颗粒细胞SVOG 氧化应激损伤Fig 1 H2O2-induced oxidative damage in human ovarian granulosa cells SVOG

图3 SIRT1 过表达质粒转染后对人卵巢颗粒细胞SVOG 的P66SHC 与BCL-2 mRNA 和蛋白表达水平的影响Fig 3 Effects of SIRT1 overexpression plasmid transfection on mRNA and protein expression levels of P66SHC and BCL-2 in the human ovarian granulosa cells SVOG

图4 SIRT1 过表达质粒转染后对H2O2 诱导人卵巢颗粒细胞SVOG 氧化应激损伤的影响Fig 4 Effect of SIRT1 overexpression plasmid transfection on oxidative stress injury induced by H2O2 in human ovarian granulosa cells SVOG

2.5 过表达SIRT1 对氧化应激状态下SVOG 细胞P66SHC及BCL-2 表达的影响

SIRT1 过表达后，氧化应激状态下SVOG 细胞的P66SHC 及BCL-2 mRNA 和蛋白表达水平见图5。qPCR结果显示，SVOG 细胞转染SIRT1 过表达质粒及H2O2处理后与H2O2组比较，P66SHC 表达下降（P=0.002），BCL-2 表 达 升 高（P=0.013）。Western blotting 结 果与qPCR 的结果一致。这表明SIRT1 可能是通过调控P66SHC 及BCL-2 的表达参与H2O2诱导的SVOG 细胞氧化应激损伤。

图5 SIRT1 过表达质粒转染后对氧化应激状态下人卵巢颗粒细胞SVOG 的P66SHC 与BCL-2 mRNA 和蛋白表达水平的影响Fig 5 Effects of SIRT1 overexpression plasmid transfection on mRNA and protein expression levels of P66SHC and BCL-2 in human ovarian granulosa cells SVOG under oxidative stress

3 讨论

正常情况下，机体内的氧化与抗氧化系统维持动态平衡。当这种平衡状态被有害刺激打破时，就会导致氧化应激损伤，表现为多种疾病组织病理渐进性损伤变化。在女性生殖系统中，氧化应激可导致卵巢颗粒细胞功能异常甚至凋亡[13]，进而导致卵巢功能受损，但其具体机制尚未阐明。本研究采用H2O2处理SVOG 细胞株，建立颗粒细胞体外氧化应激损伤模型，探索缓解卵巢颗粒细胞氧化应激损伤的分子靶点及其作用机制。

作为ROS 的主要成员，H2O2产生的羟自由基可引发脂质过氧化反应，促进ROS 产生，诱导细胞氧化损伤。我们的早期研究[12]在滋养细胞上也观察到H2O2能够诱导滋养细胞氧化损伤，促进ROS 产生，破坏线粒体膜电位。因此，本研究也通过H2O2处理来诱导卵巢颗粒细胞氧化损伤，建立氧化应激模型。本实验结果显示，H2O2处理后SVOG 细胞活力下降，细胞核明显缩小，染色质凝集呈颗粒团块状分布，表明颗粒细胞发生凋亡。氧化应激可导致机体内抗氧化物质和氧化物生成之间的不平衡状态，过量ROS 能够攻击细胞生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，并形成脂质过氧化物。MDA 是脂质过氧化反应的重要产物，能引起蛋白质、核酸等生物大分子的交联，产生细胞毒性作用。另一方面，ROS 消耗细胞内的抗氧化物质，引起细胞内抗氧化酶（如SOD）活性下降[14]。SVOG 细胞经H2O2处理后，脂质过氧化物MDA 水平显著升高，而抗氧化酶SOD 水平明显下降；说明H2O2处理能够有效诱导卵巢颗粒细胞产生氧化应激损伤。

SIRT1 可以通过对其底物分子的去乙酰化作用，参与多种细胞生理过程。大量研究表明，SIRT1 参与调控细胞的氧化应激从而影响细胞的存活。Gay 等[15]报道在H2O2诱导的神经元细胞氧化损伤模型中SIRT1 表达下降；Prola等[16]研究发现，抑制或降低SIRT1 活性会加重内质网诱导型心肌损伤，激活SIRT1 则会对心肌细胞产生保护作用。近年来的研究表明SIRT1 也参与调控卵巢功能。如在肥胖小鼠中，使用SIRT1 激动剂可以通过激活SIRT1 信号通路以及抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路恢复卵巢功能，并且延长卵巢的寿命[9]。在多囊卵巢综合征大鼠模型体内，卵巢表达SIRT1 的水平显著下降[8]。Lai 等[17]报道，患有多囊卵巢综合征的不孕妇女颗粒细胞的氧化应激水平高于输卵管因素导致的不孕妇女，可能进一步影响卵子和胚胎质量，从而影响体外受精胚胎移植的助孕结局。本研究在卵巢颗粒细胞体外氧化应激损伤模型中也发现，250 μmol/L H2O2处理12 h 可诱发SVOG 细胞氧化应激损伤，同时SIRT1表达降低；而SVOG 细胞转染SIRT1 过表达质粒后再经H2O2处理，细胞MDA 含量下降，SOD 活性上升，表明上调SIRT1 表达具有抗卵巢颗粒细胞氧化应激损伤作用。

衔接蛋白P66SHC 是调控氧化应激和生命周期的关键因子，可以感知氧化应激信号的刺激，从细胞质转位至线粒体，氧化细胞色素C 产生大量ROS，造成细胞的氧化损伤[18]。研究[19]发现，小鼠P66shc 基因敲除后，机体对抗氧化应激诱导的DNA 损伤和细胞凋亡能力增强，寿命延长。SIRT1 是调控细胞氧化应激的重要分子，可以通过直接或间接途径调控P66SHC 表达。Wils 等[20]研究发现，在高糖诱导的心血管内皮损伤过程中，SIRT1 和P53 均可通过影响P66SHC 的表达水平调控ROS 的产生；在组织和DNA 损伤时，SIRT1 可通过作用于P53，减少P53 依赖的细胞凋亡[21]；而P66SHC 作为P53 的下游信号分子参与氧化应激介导的细胞凋亡[22]。本研究发现H2O2诱导SVOG 细胞氧化损伤，伴随着SIRT1 表达下降，P66SHC表达显著升高。过表达SIRT1 基因则抑制P66SHC 基因表达，细胞氧化损伤减轻。这些结果提示SIRT1 可能通过抑制P66SHC 的表达从而缓解H2O2诱导的细胞氧化 损伤。

氧化应激状态下，ROS 过量导致DNA 损伤，可激活P53 并快速转移到线粒体，与线粒体膜上的BCL-2 家族成员相互作用，调节细胞凋亡[23]。BCL-2 能够阻止细胞色素c 从线粒体释放到细胞质，从而抑制细胞凋亡，是参与调控线粒体凋亡途径的凋亡抑制蛋白[24]。BCL-2 也可以通过减少氧自由基的产生和脂质过氧化物的形成，发挥间接的抗氧化作用[25]。本研究显示，在H2O2诱导的SVOG 细胞氧化损伤模型中，SIRT1 表达下降的同时，BCL-2 表达下降；SIRT1 过表达后再经H2O2处理，BCL-2 表达上调。这些结果提示SIRT1 可能通过上调BCL-2 表达缓解H2O2诱导的细胞氧化损伤。

综上所述，在H2O2诱导的人颗粒细胞SVOG 体外氧化应激损伤模型中，调控细胞氧化应激的SIRT1 表达降低；转染过表达SIRT1 后，SVOG 细胞氧化损伤减轻，促过氧化损伤的P66SHC 表达下调，抗过氧化的BCL-2 表达上调。本研究发现了SIRT1 参与调控人卵巢颗粒细胞氧化应激损伤的一种可能机制，进一步的研究将有望为临床上保护卵巢功能的治疗提供新的靶点。

参·考·文·献

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