TGF-β对水牛卵泡颗粒细胞的影响

魏耀昶，刘青云，程佳瑞，邹超霞，邓彦飞

（广西大学动物科学技术学院亚热带生物资源保护与利用国家重点实验室，广西 南宁 530004）

因水牛具有耐粗饲、耐高温、抗病力强，以及奶营养价值高等优势，水牛养殖业已成为广西的特色支柱产业。但是水牛卵巢生长卵泡少，卵泡闭锁率高，严重制约了水牛产业的发展。因此，探究水牛卵泡发育和卵泡闭锁机制有助于提高水牛繁殖效率。

颗粒细胞的凋亡被认为是卵泡闭锁的重要诱导因子[1]，其增殖分裂、调亡、分泌的类固醇激素和细胞因子对卵泡的发育及闭锁起着至关重要的调节作用，卵母细胞所需的营养物质如核酸、能量是通过颗粒细胞获得的[2]。卵泡中10%以上的颗粒细胞凋亡后，认为该卵泡已经闭锁；因细胞凋亡是不可逆的，所以卵泡闭锁也是不可逆转的，一旦发生闭锁，卵泡就不能继续正常发育。

TGF-β超家族是一组结构保守但功能多样的蛋白质，在脊椎动物中至少有35个成员。这些蛋白质广泛分布于全身，作为细胞外配体参与产前和产后的许多生理过程。大多数TGF-β超家族成员通过与细胞表面指定为I型和II型的两种丝氨酸/苏氨酸激酶受体结合并形成异源四聚体复合物，对靶细胞发挥作用[3]。越来越多的试验证据支持它们在卵泡发育的多个方面发挥关键作用的说法，包括原始卵泡募集、颗粒和卵泡膜细胞增殖/闭锁、类固醇生成、促性腺激素受体表达、卵母细胞成熟、排卵、黄体化和黄体（CL）形成[4-5]。然而，关于TGF-β调节颗粒细胞状态的研究仍然有争议。有报道显示，TGF-β可以通过smad通路增加颗粒细胞的凋亡率[6-7]。也有报道显示，TGF-β单独作用对颗粒细胞无影响，而TGF-β与 TGF-α协同作用就可以诱导颗粒细胞凋亡，促进卵泡闭锁[8]。

为了进一步探究TGF-β对卵泡颗粒细胞的影响，本研究以水牛为对象，重点关注TGF-β对水牛颗粒细胞状态的影响，为研究TGF-β对卵泡发育的影响提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

DMEM高糖基础液体培养基（Gibco）、胎牛血清（Gibco）、青霉素/链霉素和胰酶均购自北京索莱宝公司；CCK-8试剂购自诺唯赞生物科技有限公司；BD pharmingen FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit1购自BD生物科技公司；牛孕酮和雌激素ELISA检测试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司；TGF-β购自北京索莱宝公司。

1.2 水牛卵泡颗粒细胞的体外培养

从南宁当地屠宰场采集非妊娠水牛的卵巢，放入37℃灭菌生理盐水，1 h内运回实验室进行试验。卵巢先用75%的酒精润洗消毒，剪下多余的卵巢系膜组织，之后用37℃生理盐水清洗3遍，将血水洗净。将清洗干净的卵巢置于高压灭菌后的纱布上，选取3～9 mm的卵泡，用15 mL注射器吸取卵泡中的卵泡液，并收集在离心管中。将收集的卵泡液用40μm的细胞筛过筛，收集液体，1500 rpm离心3 min。弃上清，用含双抗的PBS清洗颗粒细胞3遍，并离心弃上清。用含双抗和10%胎牛血清的DMEM重悬颗粒细胞，并置于培养皿中培养（37 ℃，5% CO2），12 h 后更换无双抗的DMEM。

1.3 CCK-8检测

取对数生长期的水牛卵泡颗粒细胞培养在96孔板中，用 0 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL浓度的 TGF-β 分别于 1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、48 h（每组3个重复）处理水牛卵泡颗粒细胞。分别向每个孔中添加10μL CCK-8试剂，在培养箱中继续培养2 h。利用酶标仪（TECAN公司）在450 nm处检测OD值。

1.4 流式细胞术检测

取对数生长期的水牛卵泡颗粒细胞培养在24孔板中。根据CCK-8结果选取20 ng/mL的浓度，分别于 1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、48 h （每组 3 个重复）处理水牛卵泡颗粒细胞。用胰酶消化后将细胞收集在1.5 mL离心管中，并用PBS清洗1次。加入500μL binding buffer，轻柔吹打均匀后，分别加入5 μL Annexin V FITC和10μL PI。吹打混匀后 15 min内利用流式细胞仪检测。

1.5 孕酮和雌激素的检测

取对数生长期的水牛卵泡颗粒细胞培养在24孔板中。根据CCK-8结果选取20 ng/mL的浓度培养水牛卵泡颗粒细胞24 h。收集细胞培养液，用ELISA试剂盒检测培养液中E2和PROG浓度。用酶标仪(TECAN)按照制造商的方案检测样品。E2和PROG的检测范围分别为40～1 000 pg/mL和0.15～70 ng/mL。检测灵敏度分别为40 pg/mL和0.5 ng/mL，检测内变异系数均小于15%。

1.6 统计学方法

所有数据采用GraphPad Prism 8.0进行分析。两组间的统计学差异采用t检验，超过两组的统计学差异采用方差分析（ANOVA）。P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 TGF-β对水牛卵泡颗粒细胞增殖的影响

为了检测TGF-β对水牛卵泡颗粒细胞增殖的影响，本试验利用CCK-8试剂盒分别检测了不同浓度和不同处理时间后的OD值。结果发现，随着TGF-β浓度的升高，OD值逐渐升高（如图1所示），TGF-β在不同培养时间下，OD值逐渐上升的趋势不变，证明TGF-β可以促进水牛卵泡增殖。当TGF-β添加剂量为20 ng/mL时，无论培养多长时间，其OD值都显著高于其他处理组，在处理24 h后，随着TGF-β浓度的升高，OD值不再增加。

图1 TGF-β对水牛卵泡颗粒细胞增殖的影响

2.2 TGF-β对水牛卵泡颗粒细胞凋亡的影响

为检测TGF-β对水牛卵泡颗粒细胞凋亡的影响，本试验使用流式细胞术分别检测了添加20 ng/mL的TGF-β作用不同时间卵泡颗粒细胞的凋亡率。结果发现，用20 ng/mL的TGF-β处理水牛卵泡颗粒细胞后，细胞凋亡率没有显著变化，且随着处理时间的延长，卵泡颗粒细胞的凋亡率仍然没有显著变化（如图2-1、2-2所示）。

图2-1 TGF-β对水牛卵泡颗粒细胞凋亡的影响

图2-2 TGF-β对水牛卵泡颗粒细胞凋亡的影响

2.3 TGF-β对水牛卵泡颗粒细胞分泌孕酮（P4）的影响

在卵泡发育过程中，类固醇激素的生成和分泌对卵泡闭锁有直接影响。本研究利用ELISA检测了添加20 ng/mL的TGF-β处理水牛卵泡颗粒细胞24 h后，细胞培养液中的孕酮含量。结果显示，用20 ng/mL的TGF-β处理水牛卵泡颗粒细胞24 h后，可以显著降低水牛卵泡颗粒细胞孕酮的分泌量（如图3所示）。

图3 TGF-β对水牛卵泡颗粒细胞分泌孕酮（P4）的影响

2.4 TGF-β对水牛卵泡颗粒细胞分泌雌激素（E2）的影响

分泌雌激素是卵泡颗粒细胞最重要的功能之一。本研究利用ELISA检测了添加20 ng/mL的TGF-β处理水牛卵泡颗粒细胞24 h后，细胞培养液中雌激素的含量。结果显示，用20 ng/mL的TGF-β处理水牛卵泡颗粒细胞24 h后，细胞培养液中雌激素的含量没有显著变化（如图4所示）。

图4 TGF-β对水牛卵泡颗粒细胞分泌孕酮（E2）的影响

3 讨论

颗粒细胞的凋亡对卵泡闭锁至关重要，细胞凋亡是机体自发的程序性死亡，而促使卵泡颗粒细胞凋亡的因素众多。生殖激素是影响卵泡颗粒细胞增殖、生长和凋亡最重要的因素，并且几乎所有的生殖激素都参与其中，如 GnRH[9]、FSH[10]、LH[10]等。 在与凋亡相关基因的研究中发现， 促凋亡基因（FAS、P53、BCL2、BAX、Cas-3、Cas-9等）在卵泡闭锁中可以促进颗粒细胞的凋亡[11]。另外在卵泡闭锁期间，不仅促凋亡基因Bcl-2家族的表达升高，而且抗凋亡基因的表达在转录水平上增加，在闭锁卵泡中Bid、Bim、Bcl-2和Mcl-1基因高表达，而caspase-3、BAX和BCL-xl基因在闭锁卵泡中高表达[12]。细胞因子存在相互协同、相互制约等作用，生物学功能复杂，已经有大量研究证实了各类细胞因子在卵泡颗粒细胞凋亡过程中的作用。据报道，EGF刺激卵泡颗粒细胞的增殖，增加黄体酮、cAMP、cGMP的释放，控制雌二醇的释放，此外它刺激卵母细胞成熟、卵丘细胞增殖及维持卵泡存活[13]。10 ng/mL FGF-2可以抑制细胞凋亡并促进羊卵泡的生长[14]。有大量研究显示，转化因子TGF-β对卵泡发育至关重要，然而对TGF-β的研究还存在争议。

本试验结果显示，在体外培养的水牛卵泡颗粒细胞中添加TGF-β后可以显著增加水牛卵泡颗粒细胞的增殖能力，而对凋亡没有显著影响。这说明TGF-β对水牛卵泡颗粒细胞没有负面影响，更有利于水牛卵泡的发育。同时，本试验结果显示，TGF-β可以显著抑制水牛卵泡颗粒细胞产生孕酮，而对雌激素没有影响，这使得孕激素与雌激素的比例减少。据报道，卵泡中E2和P4的失衡与卵泡闭锁有关，在卵泡闭锁的过程中，E2浓度相对降低，P4浓度相对升高,两者比例变化已成为鉴定卵泡闭锁与否的重要指标[15]。因此，TGF-β可以减少孕酮与雌激素的比例，抑制水牛卵泡的闭锁。然而，TGF-β到底通过什么途径影响水牛卵泡颗粒细胞的状态，还需要进一步的研究。

4 结论

TGF-β可以通过促进水牛卵泡颗粒细胞的增殖、减少孕激素与雌激素的比例来减少水牛卵泡的闭锁，增加卵泡颗粒细胞的活力。