双氢睾酮对小鼠卵泡颗粒细胞增殖与抗苗勒管激素表达的影响

于 凯，赵玉芬，翁 钰，王 琴，郝绍瑜，于泊洋，杜晨光，苏布登格日勒，李海军

(1.内蒙古农业大学兽医学院，呼和浩特 010018；2.内蒙古自治区基础兽医学重点实验室，呼和浩特 010018；3.内蒙古医科大学基础医学院，呼和浩特 010110)

卵泡颗粒细胞作为卵泡内的一类功能细胞，对维持哺乳动物卵巢功能具有至关重要的作用[1]。促卵泡素(FSH)能够调节颗粒细胞的生长，促卵泡素受体(FSHR)是卵泡颗粒细胞特征性表达蛋白[2]。卵泡颗粒细胞的增殖或凋亡是卵泡发育或闭锁的主要特征。研究表明，卵巢内源性雄激素在调控卵泡发育中具有重要作用[3-7]。睾酮能通过激活蛋白激酶B(Akt)信号通路诱导小鼠原始卵泡的激活[3]；睾酮结合其雄激素受体(AR)可以促使牛初级卵泡向次级卵泡的转变[4]；此外，AR基因被敲除后，小鼠卵泡颗粒细胞凋亡增加且出现排卵异常[5-7]。因此，探讨雄激素及其受体在卵巢颗粒细胞增殖或凋亡过程中的作用，对于深入理解哺乳动物卵泡发育或者闭锁发生机理具有重要意义。

哺乳动物卵巢内主要存在4种内源性雄激素，分别为脱氢表雄酮、雄烯二酮、睾酮与双氢睾酮(DHT)，但其作用各有不同。前两者是睾酮与DHT在卵巢内合成过程的中间前体，而后两者通过结合AR发挥各自特定生理作用[8]。研究发现，在卵泡中雄烯二酮能够转化为睾酮，雄烯二酮与睾酮均可在细胞5α-还原酶的作用下不可逆地生成DHT，且DHT与AR的亲和力显著高于睾酮[9]。研究报道，体内注射睾酮或DHT后，雌猴和雌鼠卵巢内颗粒细胞与生长卵泡数量均显著增加[10-11]，说明睾酮与DHT在卵巢卵泡发育过程中具有重要作用。由于卵巢内雄激素种类多且作用机制复杂，致使相关机制研究难以深入甚至结果彼此矛盾。睾酮是参与卵泡发育与闭锁调控的一类关键内源雄激素，然而类似研究未能排除DHT的影响。有关绵羊卵巢的一项研究发现，卵泡内DHT浓度与AR的表达成正向依赖关系，随着卵泡生长发育的进行，DHT与AR的表达均逐渐下降[12]，但双氢睾酮调节早期卵泡发育的机制鲜见报道。

抗苗勒管激素(AMH)是卵巢卵泡发育过程中主要由颗粒细胞分泌的一类关键内源激素。研究发现，AMH能够抑制芳香化酶(CYP19A1)的活性，进而抑制雌二醇(E2)生成[13]。在哺乳动物卵泡发育过程中，AMH在青春期前卵泡处于较低水平，在青春期水平激增，随后逐渐下降直到更年期；在小腔卵泡中AMH表达最强，随后开始下降；在排卵前，除了卵丘细胞能够检测到少量AMH，其他细胞中几乎检测不到[14-15]。在健康卵巢中，AMH抑制有腔卵泡的发育，AMH水平下降是排卵的先决条件[14-15]。随着雄激素水平增高，血清和卵泡液中AMH水平也随之升高[16]；生理浓度下，随着DHT浓度升高，绵羊卵泡颗粒细胞中AR的表达也随之升高[12]。研究发现，DHT能够促进人颗粒细胞AMH的表达[17]。综上，DHT、AR与AMH等分子组成一个相对复杂的信号网络，共同参与了卵巢卵泡早期发育的调控过程。本研究以小鼠卵泡颗粒细胞为研究对象，通过研究DHT与AR调节剂(特异性抑制剂：Flutamide；特异性激动剂：11-ketodihydrotestosterone)对小鼠颗粒细胞增殖、AMH基因表达及蛋白水平的作用,以期为阐明DHT对卵泡发育影响的机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 50只3周龄雌性昆明小鼠(SPF级)，体重(22～25) g，由内蒙古医科大学动物实验中心提供。饲养环境温度保持在(22±1)℃，湿度保持在50%～60%，光照条件为12 h光照和12 h黑暗。

1.1.2 主要试剂 双氢睾酮(DHT)购自Sigma公司；DMEM/F12培养基购自Gibco公司；胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA)均购自CLARK Bioscience公司；青-链霉素购自Solarbio公司；雄激素受体抑制剂(Flutamide,HY-B0022)、雄激素受体激动剂(11-ketodihydrotestosterone，HY-135794)、AMH蛋白ELISA检测试剂盒均购自MCE公司；CCK-8(C6005)购自US Everbright公司；一抗Anti-FSHR(22665-1-AP)购自Proteintech公司；荧光二抗(A32732)购自Abcam公司；细胞RNA微量提取试剂盒(74034)购自QIAGEN公司；M5 Sprint qPCR RT Kit with gDNA Remover(MF949-01)、2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq(MF787-01)均购自Mei5bio公司。

1.2 颗粒细胞的收集、培养与生物学特性鉴定

1.2.1 颗粒细胞的收集、培养 给小鼠注射孕马血清促性腺激素(PMSG，10 IU/只)，48 h后以颈椎脱臼法处死，收集卵巢。将卵巢在预热的PBS中清洗2次，转移到预热的DMEM/F12培养基中(含1%的青-链霉素)，使用1 mL注射器针头刺破卵泡，在培养箱中静置3 min。使用300目一次性过滤筛进行过滤，1 200 r/min离心5 min，弃上清后加入培养基吹打悬浮，再次进行离心，加入含10% FBS的DMEM/F12培养基吹打悬浮，接种在培养瓶中，隔天换液。

1.2.2 颗粒细胞的形态鉴定 将细胞培养瓶中的颗粒细胞传代到24孔板中，培养48 h后使用PBS清洗(3次，5 min/次)；使用预冷的4%多聚甲醛固定20 min，用PBS清洗；苏木精染色15 min，1%盐酸分化液中作用30 s，流水冲洗干净；HE染色1 min，使用95%乙醇进行调色；梯度酒精脱水：95%乙醇5 s→95%乙醇5 s→100%乙醇1 min；用中性树脂将细胞爬片固定在载玻片上(细胞面朝上)，放入烧杯中使用二甲苯透明2次，每次1 min，立式光学显微镜(SZX16，OLYMPUS)下观察并拍照。

1.2.3 颗粒细胞的生长曲线绘制 采用CCK-8检测细胞的增殖。将细胞培养瓶中的细胞(3×104/mL)接种到96孔板中(100 μL/孔)培养，每天取一排孔滴加CCK-8(10 μL/孔),培养箱中培养1 h后，用酶标仪检测D450 nm值，重复此操作7 d，绘制细胞的生长曲线。

1.2.4 颗粒细胞FSHR表达鉴定 将颗粒细胞接种到共聚焦小皿上，当汇合度达50%时，使用PBS清洗；使用预冷的4%多聚甲醛固定20 min，用PBS洗3次，5 min/次；使用0.3% Triton X-100室温通透20 min，用PBS洗3次；5% BSA室温封闭30 min，加入一抗Anti-FSHR(1∶200)，4 ℃湿盒中孵育过夜；用PBS洗3次，加荧光二抗(1∶200)，避光，湿盒中37 ℃孵育1 h，用PBS洗3次，加抗荧光衰减剂，封片后在显微镜下观察并拍照。

1.3 不同浓度DHT对小鼠颗粒细胞增殖的影响

将第2代颗粒细胞接种到6孔板中(3×104/孔)，当细胞汇合度达到50%时用无血清的DMEM/F12培养基饥饿处理12 h，然后在培养基中添加不同浓度DHT(0、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)培养48 h，用0.25%胰酶消化细胞，用细胞计数板计数每组细胞，检测颗粒细胞增殖情况。

1.4 不同浓度DHT对小鼠颗粒细胞中AMH mRNA及蛋白含量的影响

1.4.1 实时荧光定量PCR检测AMH mRNA的表达 按照1.3中的处理方法，在培养基中添加0、10-7、10-5mol/L DHT，培养48 h后收集细胞。Trizol法提取各组细胞总RNA并反转录合成cDNA。根据GenBank中小鼠AMH基因序列(登录号：11705)，使用Primer Premier 5.0软件设计引物，具体信息见表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以β-actin为内参基因进行实时荧光定量PCR。PCR反应体系20 μL：Hieff®qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，Primer Mix 1 μL，cDNA 3 μL，ddH2O 6 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性15 s；57 ℃退火15 s；72 ℃延伸，60 s，共35个循环。

表1 引物信息

1.4.2 ELISA法检测AMH蛋白的含量 收集1.4.1各组颗粒细胞，按照ELISA试剂盒说明书检测AMH蛋白的含量。

1.5 DHT与AR调节剂联合处理对小鼠颗粒细胞增殖及AMH蛋白含量的影响

将第2代颗粒细胞接种到6孔板中(3×104/孔)，当细胞汇合度达到50%时用无血清的DMEM/F12培养基饥饿处理12 h。然后在培养基分别添加10-6mol/L Flutamide、10-7mol/L DHT、10-7mol/L DHT+10-6mol/L Flutamide、10-5mol/L DH、10-5mol/L DHT+10-8mol/L 11-ketodihydrotestosterone，分别记为F、D7、DF、D5、DK组，以不添加药物为对照组。培养48 h后，按1.3的方法检测颗粒细胞增殖情况；按1.4.2方法检测各组颗粒细胞AMH蛋白含量。

1.6 数据统计与分析

用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，采用Post Hoc检验组间差异，结果以平均值±标准差表示。P<0.05表示差异显著；P<0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 小鼠卵泡颗粒细胞的分离培养及鉴定

HE染色结果显示，颗粒细胞贴壁后呈梭形或铺路石状(图1A)；细胞生长曲线呈S型(图1B)，表明细胞传代后仍能保持原有的生长活力。细胞免荧光结果显示，小鼠颗粒细胞普遍表达FSHR(图2)。表明分离的颗粒细胞纯度较高，可用于后续研究。

2.2 不同浓度DHT对小鼠颗粒细胞增殖的影响

由图3可知，在10-9～10-7mol/L浓度范围内，随着DHT浓度升高，细胞数量逐渐上升；在10-7～10-5mol/L浓度范围内，随着DHT浓度升高，细胞数量逐渐下降。与0 mol/L DHT组相比，10-8mol/L DHT组细胞增殖显著增加(P<0.05)，10-7mol/L DHT组细胞增殖极显著增加(P<0.01)，10-5mol/L DHT组细胞增殖显著降低(P<0.05)。后续试验用10-7和10-5mol/L DHT处理颗粒细胞。

图1 颗粒细胞形态观察(A，100×)和生长曲线(B)Fig.1 Morphology observation (A,100 ×) and growth curve (B) of granulosa cells

图2 颗粒细胞免疫荧光结果(100×)Fig.2 Immunofluorescence results of granulosa cells (100×)

与0 mol/L DHT组相比，*，差异显著(P<0.05)；**，差异极显著(P<0.01)；无*，差异不显著(P>0.05)。图4同Compared with the treatment group of 0 mol/L DHT,*,Significant difference(P<0.05);*,Extremely significant difference (P<0.01)；No *,No significant difference(P<0.05).The same as table 4图3 不同浓度DHT对小鼠颗粒细胞增殖的影响Fig.3 Effects of different concentrations of DHT on the proliferation of mouse granulosa cells

2.3 不同浓度DHT对小鼠颗粒细胞中AMH mRNA和蛋白含量的影响

由图4可知，与0 mol/L DHT组相比，10-7mol/L DHT组AMH mRNA与蛋白含量均极显著增加(P<0.01)，10-5mol/L DHT组AMH mRNA与蛋白含量无显著差异(P>0.05)。

图4 不同浓度DHT对小鼠颗粒细胞中AMH mRNA(A)和蛋白含量(B)的影响Fig.4 Effects of different concentrations of DHT on AMH mRNA (A) and protein content (B) in mouse granulosa cells

2.4 DHT与AR调节剂联合处理对小鼠颗粒细胞增殖的影响

由图5可知，对照组与F组颗粒细胞数量无显著差异(P>0.05)；与D7组相比，DF组颗粒细胞的数量极显著下降(P<0.01)；与D5组相比，DK组颗粒细胞数量极显著升高(P<0.01)。

①C，对照组；F，10-6 mol/L Flutamide组；D7，10-7 mol/L DHT组；DF，10-7 mol/L DHT+10-6 mol/L Flutamide组；D5，10-5 mol/L DHT组；DK，10-5 mol/L DHT+10-8 mol/L11-ketodihydrotestosterone组。②**，差异极显著(P<0.01)；ns，差异不显著(P>0.05)。图6同①C,Control group;F,10-6 mol/L flutamide group;D7,10-7 mol/L DHT group;DF,10-7 mol/L DHT and 10-6 mol/L flutamide combined treatment group;D5,10-5 mol/L DHT group;DK,10-5 mol/L DHT and 10-8 mol/L 11 ketodihydroprosterone combined treatment group.②**，Extremely significant difference (P<0.01)；ns,No significant difference (P>0.05).The same as fig.6图5 不同浓度DHT与AR调节剂的联合处理对于小鼠颗粒细胞增殖的影响Fig.5 Effects of combined treatment of different concentrations of DHT and AR regulator on the proliferation of mouse granulosa cells

2.5 DHT与AR调节剂的联合处理对于小鼠颗粒细胞中AMH蛋白含量的影响

由图6可知，对照组与F组中颗粒细胞的AMH蛋白含量差异不显著(P>0.05)；与D7组相比，DF组中颗粒细胞的AMH蛋白含量极显著降低(P<0.01)；与D5组相比，DK组AMH蛋白含量极显著增加(P<0.01)。

图6 不同浓度DHT与AR调节剂联合处理对小鼠颗粒细胞中AMH蛋白含量的影响Fig.6 Effects of combined treatment of different concentrations of DHT and AR regulator on the content of AMH protein in mouse granulosa cells

3 讨 论

雌性动物性成熟后，卵巢卵泡发育即启动，进入一个周而复始且较为复杂的生长周期。研究显示，卵巢内源性雄激素的合成与分泌对卵泡募集与选择具有关键作用[6]。因此，探讨雄激素对卵泡颗粒细胞增殖的影响机制，可为深入理解卵泡发育或闭锁发生机制提供重要依据。卵泡颗粒细胞增殖以及卵泡腔大小的增加是排卵前卵泡由小变大的必要条件[18-20]。本研究采用机械法收集小鼠卵泡颗粒细胞，鉴定结果显示，分离的小鼠颗粒细胞表达颗粒细胞特异性标记FSHR，且经体外传代培养后仍具有较高的纯度与良好的增殖能力。

在卵泡发育过程中，DHT主要是由睾酮在5α-还原酶的作用下转化而来。研究表明，5α-还原酶和DHT在早期卵泡发育阶段都处于较高水平[9,12]，说明DHT对早期卵泡生长发育具有重要作用。本研究结果显示，10-7mol/L DHT能够极显著促进颗粒细胞增殖和AMH蛋白分泌，而10-5mol/L DHT则显著降低颗粒细胞增殖，且不同浓度DHT处理下，细胞增殖变化和AMH基因与蛋白含量变化趋势基本一致。研究报道，10-7mol/L DHT能够显著促进大鼠颗粒细胞的增殖[21]，10-8mol/L DHT能够显著促进人颗粒细胞AMH的表达[22]，而10-5mol/L DHT显著抑制大鼠颗粒细胞的增殖[21,23]，10-5mol/L DHT虽造成人颗粒细胞中AMH的表达下降，但差异不显著[22]。这些研究结果说明卵泡内DHT含量变化可能是AMH表达与颗粒细胞增殖改变的一个前提条件。从腔前卵泡到有腔卵泡的发育过程中，卵泡内源激素DHT和AMH的表达随着发育逐渐下降，且对体外培养的人颗粒细胞研究表明AMH能够抑制颗粒细胞凋亡基因的表达[17]。本研究结果表明，10-7mol/L DHT对颗粒细胞增殖的促进作用可能与AMH的抗凋亡作用有关；10-5mol/L DHT所造成的颗粒细胞增殖减弱可能与AMH表达下降有关。但是DHT通过何种途径参与小鼠颗粒细胞AMH表达调节需进一步研究。

DHT是卵泡发育过程中一种主要的雄激素形式。在绵羊颗粒细胞上的研究发现，在DHT生理浓度范围内，随着DHT浓度逐渐升高，AR表达也逐渐增强[12]；基于小鼠多囊卵巢综合征(PCOS)模型的研究也表明，经由DHT诱导的PCOS模型小鼠卵泡发育受损[7]。本研究结果表明，10-7mol/L DHT+ 10-6mol/L Flutamide联合处理组颗粒细胞的数量和AMH蛋白含量均显著低于10-7mol/L DHT组，10-5mol/L DHT+10-8mol/L 11-ketodihydrotestosterone联合处理组颗粒细胞数量和AMH蛋白含量均显著高于10-5mol/L DHT组，说明AR抑制剂能够抑制10-7mol/L DHT对颗粒细胞增殖和AMH表达的促进作用，AR激动剂能够抵消10-5mol/L DHT对颗粒细胞增殖和AMH表达的抑制作用。

4 结 论

本研究发现，10-7mol/L DHT促进体外培养的小鼠卵泡颗粒细胞的增殖及AMH的表达，10-5mol/L DHT抑制细胞增殖及AMH的表达；AR抑制剂可抑制10-7mol/L DHT的促进作用，AR激动剂可抵消10-5mol/L DHT的抑制作用。说明AR介导了DHT调控颗粒细胞增殖和AMH的表达。