土木香内酯抑制宫颈癌细胞的增殖及其机制研究

2020-03-13 09:52谢丽霞许倩倩徐红霞杜凯丽桑明孙晓东
实用医学杂志 2020年3期
关键词:内酯质粒克隆

谢丽霞 许倩倩 徐红霞 杜凯丽 桑明,2,3 孙晓东,2,3

湖北医药学院1附属襄阳市第一人民医院中心实验室,2武当特色中药研究湖北省重点实验室,3胚胎干细胞研究湖北省重点实验室(湖北襄阳441000)

宫颈癌是威胁女性健康最常见的第二大恶性肿瘤,且发病年龄逐渐年轻化。中国每年新发病例达13.15万,死亡人数每年约5.3万,约占全部女性恶性肿瘤死亡人数的18.4%[1]。患者接受放、化疗后,都伴随有严重的不良反应和并发症[2]。故寻找高效、毒副作用小且廉价的治疗药物和方法迫在眉睫。中药单体的抗肿瘤效果引起了全世界的关注,其中,土木香内酯(Alantolactone,AL)是提取自土木香等中草药植物的一种倍半萜烯内酯类化合物,广泛存在于菊科属植物中,土木香内酯具有多种生物活性,在抗肿瘤方面的作用日益受到关注[3-9]。BMI1原癌基因(BMI1 proto-oncogene,polycomb ring finger,BMI1)编码一种环指蛋白,该蛋白是多梳家族(polycomb group complex 1,PRC1)的主要成分,主要通过染色质重构在胚胎发育和干细胞自我更新过程中起重要作用[10],该基因是一种致癌基因,异常表达与许多癌症有关,并与化疗药物的耐药性有关。有报道BMI1在多种肿瘤中均有呈高表达[11-17],其高表达与肿瘤进展相关,预示肿瘤具有高度转移潜能[13,15,17-18]。AL 是否通过抑制BMI1的表达阻滞宫颈癌细胞的增殖,尚不明确,本文旨在通过施予AL后检测宫颈癌Hela细胞中BMI1的表达水平,探讨其抗癌机制,为宫颈癌的临床治疗提供新途径奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与试剂 Hela细胞购自中国科学研究院上海细胞生物研究所。土木香内酯标准品(D0221)购自上海宝曼生物科技有限公司;细胞培养及研究所用的高糖DMEM、胰酶、胎牛血清购自Gibco公司(美国);Trizol购自Invitrogen;逆转录酶、RNA酶抑制剂购自Promega公司(美国),SYBR Green PCR Mix购自Bio-Rad公司(美国);兔抗BMI1多克隆抗体、小鼠抗GAPDH多克隆抗体购自Cell Signaling Technology(美国);HRP标记的山羊抗兔和马抗小鼠的二抗购自Abbkine公司(美国)。其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。实验所用引物由金凯瑞生物工程有限公司合成(武汉),BMI1过表达质粒由湖南丰汇生物科技公司设计合成(长沙),shRNA干扰质粒、转染试剂MATE Plus由上海吉玛制药技术有限公司设计、合成。

1.1.2 仪器与设备 SpectraMax i3X多功能酶标仪购自Molecular Devices公司(美国),Ⅸ70倒置显微镜购自Olympus公司(日本),ABI 7500-PCR仪购自Life technology公司(美国),垂直电泳设备、蛋白转印设备、蛋白/核酸凝胶成像仪均BioRad公司(美国)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及药液稀释 Hela细胞用含10%FBS和1%双抗的DMEM高糖培养基培养,置于5%CO2,37℃恒温培养箱中培养至对数生长期,用于后续实验。无水乙醇溶解土木香内酯(AL),使储存浓度为100 mmol/L,-20℃避光保存备用。使用时采用DMEM高糖完全培养基稀释至实验所需浓度。

1.2.2 CCK-8检测细胞活性 取对数生长期细胞,消化计数后接种于96孔板中,每孔5 000个细胞,每组设4个复孔,37℃培养24 h,弃去培养基,向孔板中加入含不同浓度 AL(0、2.5、5.0、10、20、40、80 μmol/L)的新鲜培养基,37℃恒温孵育24 h后,在各孔中加入10 μL CCK-8试剂,37℃恒温摇床孵育2~4 h终止,采用酶标仪测定在450 nm处的OD值。计算细胞活性以及AL的IC50值。

1.2.3 平板克隆形成实验 将对数生长期的细胞消化计数后接种至6孔细胞培养板每孔分别接种100个细胞,置37℃,5%CO2培养箱中培养24 h,分别更换 2 mL 含不同浓度 AL(0、1.25、2.5、5.0 μmol/L)的培养基连续培养2~3周,每周换液一次;显微镜下观察对照组有明显的50个细胞以上的克隆形成时,弃去上清液,PBS洗2次,加4%多聚甲醛固定15 min,去固定液,加0.1%结晶紫染色液染20 min,洗去染色液,干燥后拍照,计算克隆形成率。

1.2.4 q-PCR检测BMI1基因表达 收集经0、1.25、2.5、5.0 μmol/L AL处理24 h后的细胞,抽提总RNA,用m-MLV逆转录酶和Oligo(dt)20逆转录合成cDNA,按SYBR Green试剂说明进行,PCR体系为20 μL,反应条件:95 ℃ 变性15 s,58 ℃ 退火15 s,72℃延伸20 s,40个循环。每个样品设3个复孔,Ct取其平均值,以GAPDH作为内参。引物序列如下:GAPDH,F:5′-GGCCTCCAAGGAGTAAGACC-3′,R:5′-CAAGGGGTCTACATGGCAAC-3′;BMI1,F:5′-AGTGACTCTGGGAGTGACAAGG-3′,R:5′-ATTGGTGGTTACCGCTGG-3′。

1.2.5 Western blot检测 收集经过AL处理的细胞,提取总蛋白,采用BCA法测定蛋白浓度,每组以30 μg总蛋白量进行上样,经凝胶电泳分离,采用湿转法将蛋白转至PVDF膜上,5%脱脂奶粉封闭1 h,一抗孵育过夜后洗膜,再孵育二抗2 h,洗膜显影。

1.2.6 过表达和敲低BMI1基因 取对数期的细胞,调整细胞浓度为5×104/mL,接种2 mL/孔于6孔板中,接种100 μL/孔于96孔板,分别设空载对照组、过表达组/敲低组、过表达+AL/敲低+AL组,待细胞汇合度达到60%~70%时,进行质粒转染,37℃5%CO2培养箱中培养24 h,再加入终浓度5.0 μmol/L的AL继续培养24 h。BMI1重组质粒由湖南丰汇生物技术有限公司合成,shRNA干扰序列由上海吉玛公司设计合成。

1.3 统计学方法 应用Graph pad 7.0软件对各实验的结果数据进行分析,计量资料以表示,两组间数据用t检验,多组间数据用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AL抑制Hela细胞的活性 Hela细胞经不同浓度的AL处理后,CCK-8法检测结果显示,AL能显著抑制Hela细胞的增殖,浓度5.0 μmol/L的AL即可显著抑制Hela细胞活性(P<0.01),且AL对Hela细胞活性的抑制呈剂量依赖性(图1A);计算AL在24 h对Hela细胞的IC50为21.66 μmol/L(图1B)。

2.2 AL抑制Hela细胞的克隆形成能力 平板克隆形成实验结果显示,随着药物浓度的增加Hela细胞的克隆能力显著下降且呈剂量依赖性(图2A),统计各组克隆数目,比较结果显示1.25 μmol/L的AL即可显著抑制Hela细胞克隆形成(P<0.01),随AL浓度增加克隆形成率逐渐下降(图2B)。显微镜下观察克隆及细胞形态,发现对照组克隆较大,细胞间连接紧密,保持Hale细胞的典型形态;AL作用后,克隆较小,细胞间空隙增加;随浓度增高细胞形态发生变化,细胞核增大、细胞膜向外形成突触样结构。见图2C。

图1 AL抑制Hela细胞的活性Fig.1 AL inhibited the activity of Hela cells

图2 AL抑制Hela细胞克隆形成Fig.2 AL inhibited the colony formation of Hela cells

2.3 AL抑制BMI1的表达 q-PCR检测结果显示,不同浓度AL处理Hela后,BMI1的表达受到显著抑制,随着AL浓度的增加,BMI1的mRNA表达明显降低(P< 0.05);见图3A,Western blot检测结果表明AL能在蛋白水平抑制BMI1的表达(P<0.01,图3B)。BMI1过表达质粒转染Hela细胞24 h后,PCR检测和Western blot检测均显示BMI1表达水平升高(P<0.01),再加入AL处理24 h,BMI1表达在mRNA水平和蛋白水平均被AL抑制(P<0.05),见图3C、D。

图3 AL抑制BMI1的表达Fig.3 AL inhibited the expression of BMI1

2.4 AL抑制BMI1过表达引起的Hela细胞增殖提高shBMI1抑制效率 过表达BMI1后检测Hela细胞的活力,结果显示随着过表达时间的延长细胞增殖的活力越强(P<0.001),从而表明BMI1对Hela细胞的增殖有显著的调控作用;过表达BMI1 24 h后,加入 5.0 μmol/L 的 AL,细胞活性受到抑制,且随AL作用时间延长抑制越明显(P<0.01),结果如见4A。shBMI1质粒转染Hela细胞24 h后,PCR检测,筛选出敲低效率最高的shRNA质粒,见图4B,shBMI1-588敲低效率最高,后续实验均选用该质粒进行。PCR检测和Western blot检测均显示shBMI1-588质粒转染Hela 24 h后,BMI1基因的mRNA和蛋白表达水平均被下调(P<0.01),再加入AL处理24 h,BMI1表达在mRNA水平和蛋白水平均被AL进一步抑制(P<0.05),见图4C和4D。

3 讨论

中药单体用于抗肿瘤治疗的研究也越来越广泛[19],近年来发现了许多天然药物单体化合物具有良好的抗肿瘤活性,AL是常见的倍半萜内酯类化合物,具有不饱和的五元内酯环结构,已有文献报道其抗肿瘤机制主要包括诱导细胞外源性及内源性凋亡,AL诱导线粒体膜电位改变介导凋亡[5,20]或诱导ROS的积累介导凋亡[7,21],调节凋亡相关蛋白表达从而介导凋亡[22],或者抑制细胞周期素依赖性激酶而降低周期素的表达使细胞周期停滞而抑制增殖[9,22],AL 还可抑制肿瘤血管生成抑制肿瘤生长[23]。本研究选择宫颈癌Hela细胞作为研究对象,观察AL对Hela细胞活性及增殖能力的抑制效应,探讨AL对原癌基因BMI1的表达有什么影响以及AL通过抑制BMI1的表达对Hela细胞活性产生抑制效应的机制。

图4 AL抑制BMI1过表达引起的Hela细胞增殖提高shBMI1抑制效率Fig.4 AL inhibited the proliferation of Hela cells and promoted the inhibition efficiency of shBMI1 in Hela cells

首先给予不同浓度的AL处理,CCK8检测细胞活性降低,且抑制细胞克隆形成,表明AL对宫颈癌Hela细胞具有抑制作用,且呈明显的浓度依赖性。BMI1通过组蛋白H2A lysine119泛素化作用(UbH2A K119)下调E3连接酶和RNF144A的表达,启动细胞的无限增殖[24-25],在宫颈癌组织中,BMI1基因的高表达与更高的临床分期、肿瘤高浸润性、高转移性及宫颈癌细胞干性相关,异常升高的BMI1通过增强Sox2基因的转录调控,促进宫颈癌的致瘤性和肿瘤球的形成[26]。干扰BMI1能显著抑制AKT的活性,上调Bax的表达并下调Bcl-2的表达,从而促进肿瘤细胞凋亡[27]。由此可见,BMI1基因是维持宫颈癌进展的重要原癌基因。笔者选择小于IC50的药物浓度处理Hela细胞,Realtime PCR和Western blotting检测BMI1基因的表达,结果显示随着药物浓度的增加,BMI1在mRNA和蛋白水平的表达均显著降低。推测AL可能通过抑制Hela细胞中BMI1的表达从而抑制细胞增殖。为了进一步验证这一可能机制,本研究将Hela细胞中的BMI1基因进行过表达,发现BMI1基因过表达明显促进Hela细胞的增殖,过表达BMI1基因后再给予AL作用,可以抑制细胞的增殖;通过Real-time PCR和Western blotting检测BMI1基因的表达,结果证实AL可以抑制BMI1的过表达,同时,在shRNA质粒敲低BMI1基因的表达后,AL可以进一步抑制BMI1的表达水平。可见,BMI1基因对Hela细胞维持增殖能力至关重要,AL通过抑制BMI1基因的表达阻滞Hela细胞的增殖,而BMI1基因对抑癌基因p16INK4a的抑制会促进细胞周期的不断更新[28],AL可能是通过抑制BMI1的表达恢复p16INK4a对细胞周期的抑制作用而发挥抑癌效应。

综上所述,土木香内酯在体外能够抑制宫颈癌Hela细胞的增殖,高表达的BMI1是Hela细胞维持增殖活性的关键,土木香内酯抑制Hela细胞的活性可能是通过调控BMI1的表达来进行的。本研究为土木香内酯治疗宫颈癌提供了实验依据,也为土木香内酯的药物开发奠定了研究基础。

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