Talin2通过Caspase3信号通路调控乳腺癌细胞侵袭

董奕裕 黄晓文 李建兰

1浙江省荣军医院实验室（浙江嘉兴314000）；2武警海警总队医院检验科（浙江嘉兴314000）

肿瘤细胞自身的侵袭力和转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因［1-2］。位于肿瘤细胞周围的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）是肿瘤微环境的基本组成部分，肿瘤细胞与ECM黏附，通过ECM的降解达到转移，同时也为肿瘤生长提供必要的生长因子［3］。Talin直接与β-整合素细胞质尾部结合，然后通过其肌动蛋白结合域直接连接整联蛋白与细胞骨架［4］，对肿瘤的生长和转移起着至关重要的作用［5］。在脊椎动物中有两个Talin基因 TLN1和 TLN2，编码 Talin1和 Talin2，Talin2与Talin1有74%的同源性，Talin1可调节粘着斑（focal adhesion，FA）动力学、细胞迁移和细胞侵袭［6-7］；最近的研究［8］表明Talin2 knockdown能抑制肝癌细胞的迁移，但关于Talin2在肿瘤侵袭和转移中的作用机制目前还不清楚。本研究拟通过Talin2 shRNA慢病毒感染MDA-MB-231细胞构建Talin2 knockdown稳定细胞系，研究Talin2对MDA-MB-231细侵袭的影响，分析Talin2通过细胞凋亡途径在乳腺癌发生和发展中的作用和机制，为乳腺癌诊断和治疗提供新的方法和依据。

1 材料和方法

1.1 主要细胞、试剂 细胞株MDA-MB-231由温州医科大学检验与生命科学学院实验室保存；质粒由该实验室提供；胎牛血清、DMEM培养基购自Gibco；LipofectaminTM2000均购自 Invitrogen公司；Talin2转染细胞株通过嘌呤霉素筛选。

1.2 方法

1.2.1 细胞转染及稳定细胞系的建立 按照lipofectamintm 2000转染试剂产品操作手册进行，以pLentiLox3.7慢病毒核心空载体和包装质粒VSVG、RSV-REV和pMDLg/pRRE按一定比例混合，采用脂质体共转染慢病毒系统转染293T细胞，于37℃、5%CO2培养48～72 h。将收集的病毒微粒感染乳腺癌细胞MDA-MB-231，并过夜培养。用1 mg/mL嘌呤霉素作用于感染的细胞20 d，筛选稳定表达慢病毒shRNA空载和Talin2 shRNA的细胞系

1.2.2 免疫组织化学染色 采用两步法对组织切片行免疫组化染色。样品组织经固定、石蜡包埋后，4 μm厚度切片，50℃烘烤4 h，经脱蜡、脱水，双氧水阻断内源性过氧化物酶，柠檬酸缓冲液中微波抗原修复8 min，山羊血清室温孵育封闭1 h。Talin2（1∶150）室温孵育1 h，聚合物增强剂室温孵育20 min，酶标抗兔聚合物室温孵育20 min，常规DAB显色。以磷酸缓冲液PBS代替一抗作为纯阴性对照组。

1.2.3 体外检测侵袭实验 将细胞在无血清的培养基中饥饿培养12～24 h，用胰蛋白酶消化各组细胞，再用无胎牛血清的DMEM培养基制成浓度为10×105/mL细胞悬液。在小室中加入600 μL含有10%胎牛血清的DMEM培养基，在上室上加入各组细胞悬液100 μL/孔，在5%CO2的培养箱中37℃培养24 h。上室中培养液去除，取出膜，用棉签轻轻将上室多余的细胞擦去，PBS清洗1次后用70%的甲醇固定膜45 min，结晶紫染色5 min。用显微镜下观察迁徙至膜上的细胞，计算5个高倍镜视野中的细胞数总和，计算穿膜细胞数，细胞侵袭能力的强弱根据穿膜细胞数来评价。

1.2.4 Western Blot检测 收集细胞RIPA裂解液提取蛋白，用碧云天BCA试剂盒进行蛋白浓度测定，加入30 μg样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后，取出PVDF膜，甲醇浸泡活化1 min，放入5%脱脂奶粉中封闭1.5 h。加入山羊抗兔，Talin2 抗体（1∶1 000），Caspase3（1∶1 000）和 Phospho-caspase3（1∶1 000），Caspase8（1∶1 000）和 Phospho-caspase8（1∶1 000），PARP（1∶1000）和 cleaved-PARP（1：1 000），山羊抗小鼠抗体α-（1∶1 000），羊抗兔抗体GAPDH（1∶1 000）4℃孵育过夜（这些抗体都购置于abcam公司），TBST洗膜8 min×3次，加入二抗室温孵育1 h，TBST洗膜，经化学发光自显影方法进行成像。

1.2.5 Hoechst染色检测细胞凋亡 使用细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒（Hoechst Staining Kit，碧云天公司）检测细胞凋亡情况。将盖玻片置于70%乙醇中浸泡5 min，用PBS洗涤3次，用DMEM培养液洗涤1次。将盖玻片置于六孔板内，接种细胞培养过夜，使细胞融合度约为50%～80%。加500 μL固定液，固定10 min。弃固定液，用PBS洗2次，每次3 min。加入Hoechst 33258染色液500 μL，轻轻晃动染色5 min；倒掉染色液，用PBS冲洗2次，每次3 min，吸尽多余的液体；滴1滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片液；波长352～461 nm左右观察细胞核形态，可见已发生凋亡的细胞核呈蓝色致密光亮。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。计量资料的数据以均数±标准差表示，采用方差分析（analysis of variance，ANOVA）。以P＜0.05为有差异的统计学意义。

2 结果

2.1 Talin2在肿瘤组织和细胞中的表达 选取浙江省荣军医院新鲜的临床乳腺癌标本20例，通过4%多聚甲醛（PFA）固定至少48 h后采用免疫组化（IHC）方法检测Talin2在不同乳腺癌组织中表达水平高低。如图1C所示：在肿瘤组织中Talin2（黄褐色区域）比正常/癌旁组织中表达高，说明Talin2在乳腺癌发生、发展过程中具有一定的作用（图1C）。

重组慢病毒Talin2感染MDA-MB-231细胞后，用嘌呤霉素对感染细胞筛选。感染3～4周后收集感染组细胞扩大培养，建立稳定表达Talin2 knockdown的MDA-MB-231细胞系。通过WB检测Talin2在knockdown细胞中的表达水平，发现与对照组MDA-MB-231相比，实验组Talin2的蛋白表达量明显降低；表明Talin2 knockdown细胞系构建成功，为后续的实验奠定了基础（图1A、1B）。

图1 Talin2在MDA-MB-231细胞和乳腺癌组织中的表达水平Fig.1 Expression levels of Talin2 in MDA-MB-231 cells and breast cancer tissues

2.2 Talin2 Knock Down抑制了MDA-MB-231细胞侵袭能力 为了探讨Talin2在乳腺癌细胞侵袭中的作用，采用Transwell法比较了感染Talin2 shRNA和对照shRNA的MDA-MB-231细胞的侵袭情况。3组细胞在相同条件下连续培养48 h后，镜下随机选取视野拍照并统计穿过滤膜的细胞数目。结果表明，与对照组相比，Talin2基因敲除显著降低了MDA-MB-231细胞的侵袭性。具体来说，侵袭Talin2 shRNA1和shRNA2的敲除细胞数量分别只有对照细胞的32%和26%（图2）。因此，内源性Talin2的缺失抑制了MDA-MB-231细胞的侵袭能力。

2.3 Talin2 knockdown促进MDA-MB-231细胞发生凋亡 肿瘤的发展与细胞增殖和凋亡之间的平衡紊乱有关，细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性会增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间，用Hoechst染色法检测Talin2基因敲除后MDAMB-231细胞的形态学变化，对照组细胞的凋亡率是（8.07±0.933）%，Talin2 knockdown细胞凋亡率分别为（25.23±1.398）%和（29.73±1.452）%，两者较空白对照组分别升高了大约65%，且差异有统计学意义（P＜0.001，图3）。结果表明Talin2 knockdown明显导致细胞凋亡数目增加，促进MDA-MB-231细胞凋亡。

图2 Talin2基因敲除抑制了MDA-MB-231细胞的侵袭Fig.2 Talin2 knockdown inhibited invasion of MDA-MB-231cells

图3 Talin2shRNA诱导MDA-MB-231细胞的凋亡Fig.3 Talin2 shRNA induces apoptosis of MDA-MB-231 cells

2.4 Talin2 knockdown影响细胞凋亡信号通路相关蛋白表达水平 本研究采用Western Blot对肿瘤细胞凋亡信号通路中的相关蛋白表达水平的检测来进一步分析Talin2 knockdown诱导肿瘤细胞凋亡的原因，凋亡过程的详细机制尚不完全清楚，但是已经确定半胱天冬蛋白酶（Caspase）在凋亡过程中是起着必不可少的作用，细胞凋亡的过程实际上是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程，细胞凋亡受到严格调控，在正常细胞Caspase处于非活化的酶原状态，凋亡程序一旦开始，Caspase被活化后发生凋亡蛋白酶的层叠级联反应，发生不可逆的凋亡。本实验在蛋白水平上检测了Caspase3、Caspase8及Caspase3作用底物多聚（ADP-核糖）聚合酶［poly（ADP-ribose）polymerase，PARP］。表达量如图4所示，Caspase3、Caspase8总的表达量在MDA-MB-231对照组细胞、Talin2 knockdown组细胞没有发生变化，但是通过基因敲除后，Talin2 knockdown细胞组与对照组MDA-MB-231细胞相比Caspase3磷酸化水平表达水平显著上调，差异具有统计学意义（P＜0.001）；同样通过基因敲除后，Talin2 knockdown细胞Caspase8磷酸化水平明显高于正常MDA-MB-231对照组细胞，差异具有统计学意义（P＜0.05）；Caspase3的作用底物PARP在MDA-MB-231对照组细胞、Talin2 knockdown组细胞总表达量没有发生变化，但是通过基因敲除后，Talin2 knockdown细胞cleaved-PARP水平明显高于正常MDA-MB-231对照组细胞，差异具有统计学意义（P＜0.05）；这提示跨膜蛋白Fas或肿瘤坏死因子（TNF）诱导的凋亡起始分子Caspase8，直接或间接激活下游效应分子Caspase3，进而诱导凋亡的发生［9］，而激活的Caspase3又切断PARP等再激活核酸内切酶（endogenous nuclease DNase），使DNA有控降解成片断化断裂，促进肿瘤细胞凋亡。

3 讨论

恶性肿瘤作为危害全球人类健康的疾病，其发病率、死亡率一直呈持续上升趋势；而肿瘤细胞的浸润性生长和转移是癌症治疗的主要障碍，也是导致癌症相关死亡率的主要因素［10］。恶性肿瘤转移的分子调控机制不甚明了导致大多数恶性肿瘤治疗难以治愈。细胞外基质是肿瘤微环境的主要组成部分，含有肿瘤生长依赖的多种生长因子和细胞因子［11］。

图4 Talin2敲低对MDA-MB-231细胞系中凋亡信号传导途径相关蛋白表达水平的影响Fig.4 Talin2 knockdown effects on expression levels of apoptotic signaling pathway associated proteins in MDA-MB-231 cell lines

Talin是细胞外基质、整合素和细胞骨架中的关键分子［12］，整合素由非激活状态变成激活状态主要是由于胞内Talin蛋白所致，在原发性肿瘤及其转移中，整合素与促纤维增生反应期间沉积的胶原结合并加速肿瘤细胞增殖，存活，化疗耐药和转移［13］。Talin有两个基因，分别编码Talin1和Talin2［14］。人们对Talin2在肿瘤侵袭和转移中的作用机制研究过程中的作用知之甚少［15］。

为探讨Talin2在乳腺癌细胞中的作用，构建了Talin2基因敲除稳定表达细胞系，并对其功能进行了检测。用WB检测Talin2在Talin2 knockdown的MDA-MB-231细胞中蛋白水平，结果显示稳定的Talin2 knockdown细胞系明显下调，另外，为了探讨Talin2在乳腺癌细胞侵袭中的作用，采用Transwell法，结果表明，Talin2 knockdown细胞穿越Transwell小室的细胞数目显著减少，因此，内源性Talin2的缺失抑制了MDA-MB-231细胞的侵袭能力说明Talin2 knockdown能抑制MDA-MB-231细胞的侵袭能力［16］。

细胞凋亡，即程序性细胞死亡。细胞凋亡可通过半胱天冬酶（cysteiny asparatate specific proteinases，Caspase）的蛋白酶家族介导的外源性或内源性途径触发［17］；Caspases是细胞凋亡机制的核心，因为它们既是细胞死亡的起始物（Caspases2、Caspases8、Caspases9和 Caspases10，主要负责凋亡途径的开始）和执行者（Caspases3、Caspases6和Caspases7，负责细胞成分的明确分裂）。起始Caspases作为非活性蛋白（酵母菌或原半胱天冬酶）产生后，通过自蛋白水解酶自动激活，这是一个通过它们与特定的结合分子相互作用而促进的过程［18］。Caspase在正常情况下以无活性的前体形式合成与贮存，一旦被激活，启动Caspases就会切断执行体Caspases，执行特定细胞底物的关键性分裂，最终导致凋亡细胞死亡［19］。两种凋亡途径融合激活效应器是Caspase3，激活导致细胞的形态学和生化改变等细胞凋亡特征，最终使细胞凋亡。实际上，肿瘤是一种发生在细胞增殖和凋亡过程不平衡状态的疾病［20］。笔者对不同组的MDAMB-231细胞用Hoechst染色法检测Talin2敲除后MDA-MB-231细胞的形态学变化，如细胞核变得凝集，大小变小，染色质部分缩聚成小球形或新月形，表明细胞发生凋亡，结果显示：对照组细胞的凋亡率是（8.07±0.933）%，Talin2 knockdown细胞凋亡率分别为（25.23±1.398）%和（29.73±1.452）%，两者较对照组升高了大约65%（P＜0.001）。结果表明Talin2 knockdown明显促进乳腺癌MDA-MB-231细胞的凋亡。另外，本研究同时检测了knockdown和对照组中磷酸化Caspase-3水平，结果显示Talin2 knockdown组显著高于对照组。目前Caspase-3的作用底物有DNA-PK、PARP、GDT酶解离抑制因子（D4-GDl）等，大多数情况下，116 kDa的PARP被蛋白酶切割以后，细胞便进入凋亡途径，最终导致细胞凋亡。PARP是Caspase底物，也被称为死亡底物（deathsubstrate），被认为是细胞凋亡的重要指标，所以Caspase3能切割PARP产生85 kDa的凋亡片段，通过WB检测knockdown和对照组中剪切的PARP指标来反映Caspase3激活的水平，本研究结果显示Talin2 knockdown组显著高于对照组。这表明了Talin2 knockdown激活Caspase3并引起级联反应激活，从而引起细胞凋亡。这也验证了我们假设Talin2基因敲除激活Caspase3，然后启动级联反应，导致细胞凋亡。

综上所述，通过短发夹RNA（shRNA）介导的干扰，建立了Talin2敲除稳定的细胞系，Talin2基因敲除显著抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的生长、转移能力和侵袭性，并导致凋亡标志物的下调、裂解Caspase3和聚ADP-核糖聚合酶的磷酸化［21］，促进细胞凋亡。Talin2水平升高可能抑制细胞死亡并增加转移［22］。这些结果为乳腺癌的诊断和治疗提供了新的靶点和依据。