坎地沙坦酯对酒精性肝纤维化小鼠TGF-β1/Smads信号通路的影响

徐旭东 段光琦 刘洁 杨辉 钱叶本

1安徽医科大学第一附属医院（合肥230022）；2皖南医学院弋矶山医院（安徽芜湖241001）

酒精性肝纤维化（alcoholic liver fibrosis，ALF）是酒精性肝病（alcoholic liver diseases，ALD）的最常见形式，为肝硬化的前驱期［1］。研究［2］表明，死于肝硬化的患者约50%由ALF引起。然而，ALF病变隐匿且无有效的诊断方法，临床发现时多处于严重的肝纤维化期。目前临床认为ALF尚可逆转，但肝硬化和肝癌则不可逆转［3-4］。因此，预防肝纤维化进展为肝硬化是主要的治疗策略。但ALF进展的机制尚不完全清楚。研究［5-6］表明，转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）在脏器纤维化病理过程中发挥关键作用，并通过活化其下游Samd信号发挥生物学功能。研究［7］证实，坎地沙坦能在组织学上诱导肝纤维化改善，但其具体作用机制尚缺乏基础研究证实。本研究旨在用坎地沙坦酯干预ALF小鼠模型，检测小鼠肝脏病理组织学改变及TGF-β1/Smads信号通路关键分子表达水平的变化，探究坎地沙坦酯改善ALF的可能机制，为临床治疗ALF提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性C57小鼠42只，体质量（20.5±2.25）g，10周龄。动物由南京医科大学南京生物医药研究院提供，许可证号：SCXK（苏）2015-0001，动物在皖南医学院附属弋矶山医院实验室饲养［温度：（22.0 ± 1）℃，湿度：（55.0 ± 1）%］。本实验小鼠有关所有操作经皖南医学院伦理委员会批准。

1.2 实验仪器 光学显微镜（德国，卡尔·蔡司），离心机（德国，艾本德），电泳仪，PCR扩增仪（加拿大，刘梅克斯），酶标仪（美国，赛默飞），切片机，包埋机。

1.3 实验试剂 乙醇、CCl4、AST、ALT和TG ELISA试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司），天狼星红染色试剂盒（上海信帆生物科技有限公司），橄榄油（南京道斯夫生物科技有限公司），兔抗小鼠TGF-β1，Smad3单克隆抗体（上海钰博生物科技有限公司），山羊抗兔二抗（北京百奥莱博科技有限公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组、建模及干预 42只小鼠随机分为空白对照组（n=8）和ALF模型组（n=34），ALF小鼠模型按照文献［8］中的方法造模，模型组给予Lieber-Decarli酒精饮食（能量：30%酒精，35%脂肪，18%蛋白质，10%碳水化合物），从Lieber-Decarli饮食的第九周喂食5次，每周加1次25%CCl4注射［0.4 mL/（kg·d）］，空白对照组接受非酒精性饮食（能量：35%脂肪，18%蛋白质，47%碳水化合物）和等量的生理盐水腹腔注射，小鼠单笼饲养以调整所有动物摄入能量相等，模型构建共91 d。成功构建ALF模型后，将ALF模型组中的24只小鼠（10只处死以确定ALF模型的建立）随机分为模型对照组、阳性对照组和实验组3组。模型对照组给予非酒精饮食和蒸馏水饲养，阳性对照组给予非酒精饮食和蒸馏水饲养，并给予水飞蓟素片干预［9-10］（0.36 mg/g），实验组给予非酒精饮食和蒸馏水饲养，并给予坎地沙坦酯干预，剂量按照动物实验给药剂量换算表换算为小鼠剂量［11］（0.021 mg/g），共干预30 d。

1.4.2 取材、切片和染色 过度麻醉处死小鼠，解剖分离小鼠肝脏，用预冷的生理盐水漂洗2～3次，切取部分置于-80℃保存，再切取约1 cm2肝组织投入40 g/L的多聚甲醛中4℃固定24 h以上。固定好的组织梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，4 μm连续切片，并进行HE和天狼星染色，光镜下观察肝组织病理变化。

1.4.3 血浆中ALT、AST和TG水平的检测 干预完成后，麻醉小鼠，腹主动脉取血4 mL；并加入含有60 μL 10%EDTA和80 μL抑肽酶的无菌离心管中混匀，3 000 r/min离心15 min，分离血浆。取上清液于-80℃保存。ALT、AST和TG检测严格按照ELISA试剂盒说明书步骤操作。检测完成后，采用Origin 16.0软件进行标准曲线拟合，并确定曲线拟合方程，计算样本各指标浓度值进行统计分析。

1.4.4 肝脏指数 肝脏指数参照文献［8］中的计算方法：

1.4.5 Western blot检测蛋白水平 将收集的小鼠肝组织置于冰上，并剪碎。加入适量蛋白酶抑制剂和蛋白裂解液，裂解30 min，12 000 r/min 4℃离心15 min，取上清、分装。BCA法测定样品蛋白浓度，加入1/4蛋白体积的Buffer缓冲液混匀，加热变性，-20℃保存。每个泳道加入等量的蛋白样品进行SDS凝胶电泳，用PVDF膜转膜，5%脱脂奶粉室温封闭 2 h，分别加入相应一抗 anti-TGF-β1（1∶1 000），anti-Smad3（1∶1 000），4 ℃孵育过夜；TBST清洗 3次，加入相应二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，ECL化学发光试剂盒显影。使用Amersham Imager 600采集图像，Image Lab V5.10软件分析，样品蛋白与β-actin灰度值比为样品待测蛋白相对表达量。

1.4.6 荧光定量PCR检测TGF-β1 mRNA和Smad3 mRNA表达情况 Trizol法提取肝组织中总RNA，测定RNA纯度和浓度。按照逆转录试剂盒说明逆转录cDNA，反应体系：纯水10 μL，1×Buffer缓冲液10 μL，dNTP Mix 1 mL，上游引物 50 pmol，下游引物 50 pmol（序列见表 1），25 mmol/L MgSO42 μL，AMV Reverse Transcriptase 1 μL，Tfl DNA Polymerase 1 μL。95℃ Tag酶活化2 min，95℃变性15 s，60 ℃退火，循环 40 次。2-△△Ct法计算 TGF-β1 mRNA和Smad3 mRNA的相对表达量。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequence

1.5 实验观察指标 （1）HE和天狼星红染色后，光镜下观察局部组织病理变化；（2）血清ALT、AST和TG水平；（3）肝脏指数；（4）Western blot检测局部组织中TGF-β1和Smad3 蛋白水平变化；（5）RT-PCR检测局部组织中TGF-β1mRNA和Smad3 mRNA表达水平。

1.6 统计学方法 用SPSS 24.0软件进行统计分析，所有数据均用（）表示。空白对照组与模型对照组比较采用两独立样本t检验；采用levene法进行方差齐性检验，方差齐时，实验组、阳性对照组和模型组间比较采用单因素方差分析，若单因素方差分析有统计学意义，实验组和阳性对照组与模型对照组比较采用LSD法，组间两两比较采用SNK法（q检验）。方差不齐时，采用Welch法进行近似方差分析；P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HE和天狼星红染色观察 HE染色可见，空白对照组肝细胞形状正常，静脉区可见少量炎性细胞。模型对照组肝组织正常结构破坏，肝细胞中存在大量炎性细胞浸润、出血和坏死，气泡样脂肪变性和排列紊乱的肝细胞；天狼星红染色可见静脉区较多的胶原沉积；阳性对照组和实验组可见明显减少的炎性细胞，少量出血和胶原沉积，肝细胞的排列明显改善（图1、2）。

图1 苏木精-伊红染色结果Fig.1 Hematoxylin&eosin staining results

图2 天狼星红染色结果Fig.2 Sirius red staining results

2.2 坎地沙坦酯对小鼠血清生化指标的影响ELISA检测结果表明，模型对照组小鼠血清ALT、AST和TG显著高于空白对照组、阳性对照组和实验组。统计分析表明，模型对照组血清ALT、AST和TG水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；阳性对照组和实验组血清ALT、AST和TG水平显著低于模型对照组，差异具有统计学意义（P＜0.01）；阳性对照组血清ALT、AST和TG水平与实验组差异无统计学意义（P＞0.05,图3A、B）。

2.3 小鼠肝指数的变化 统计结果表明，模型对照组小鼠肝脏指数显著高于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；阳性对照组和实验组肝脏指数显著低于模型对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；阳性对照组肝脏指数和实验组差异无统计学意义（P＞0.05，图3C）。

图3 坎地沙坦酯对小鼠血清ALT、AST和TG的影响和肝脏指数变化Fig.3 The effects of candesartan on serum ALT，AST and TG in mice and changes in liver index

2.4 肝组织中TGF-β1 mRNA和Smad3 mRNA水平的变化 RT-qPCR检测结果显示，模型对照组中TGF-β1 mRNA和Smad3 mRNA水平显著高于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；阳性对照组中TGF-β1 mRNA和Smad3 mRNA水平明显低于模型对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；阳性对照组中TGF-β1 mRNA和Smad3 mRNA水平与实验组差异无统计学意义（P＞0.05，图4 A、B）。

2.5 肝组织中TGF-β1和Smad3蛋白表达水平的变化 Western blot检测结果显示，模型对照组TGF-β1和Smad3蛋白表达水平显著高于空白对照组，差异有统计学（P＜ 0.01）；阳性对照组TGF-β1和Smad3蛋白表达水平明显低于模型对照组，差异有统计学（P＜0.05）；阳性对照组 TGF-β1和Smad3蛋白表达水平与实验组差异无统计学意义（P＞ 0.05，图5A、B）。

3 讨论

ALD是一个极具挑战的全球性健康问题，常导致沉重的医疗负担，并对患者生命造成极大危害。ALF作为ALD病理进程的一个关键阶段，也是目前临床认为能够可逆转的关键阶段。因此，对ALF发病机制和潜在有效治疗药物的研究在本领域备受关注。最近，研究［12］表明，在慢性肝损伤中血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，ANGⅡ）产生过多从而刺激肝星状细胞活化有助于纤维化。此外，ANGⅡ阻断剂在丙肝患者中显示出抗纤维化的作用［13-15］。临床观察［7］表明，新型 ANGⅡ型受体阻断剂坎地沙坦对ALF有缓解作用，但这类药物缓解肝纤维化的具体作用机制尚无相关研究证实。本实验目的在于通过构建ALF小鼠模型，用坎地沙坦酯干预ALF小鼠，观察干预后小鼠肝组织病理变化特征、肝脏指数、血清相关生化指标及TGF-β1/Smads信号通路相关分子的变化，以探究坎地沙坦酯对ALF的可能作用机制，为其临床应用提供科学依据。

图4 肝组织中TGF-β1 mRNA和Smad3 mRNA水平的变化Fig.4 The changes of TGF-β1 mRNA and Smad3 mRNA levels in liver tissues

图5 肝组织中TGF-β1和Smad3蛋白表达水平的变化Fig.5 The changes of TGF-β1 and Smad3 protein expression levels in liver tissues

深入研究ALF的前提是构建理想的ALF动物模型，理想的病理模型应该与人类疾病有相似的病理生理学特征。自由觅食Lieber-Decarli酒精饮食模型已被广泛地用于ALF的动物模型构建［16］，但单独使用酒精难以在实验条件下诱导动物肝纤维化［17］。因此，在本研究中，采用慢性酒精处理并伴随节点CCL4腹腔注射的“双击模型”［18］。实验结果表明，在实验中采用Lieber-Decarli酒精液体饮食联合在最后5周腹腔注射CLL4的方法，ALF模型成功构建。病理变化和人类ALF相似［19］，包括脂肪变性、肝细胞损伤、细胞外周纤维化和胶原纤维的沉积。

TG主要在肝脏中合成、分泌和分解代谢，TG的积聚在慢性肝损伤中发挥重要作用［20-21］。因此，肝功能受损导致脂肪酸向肝脏转移，导致肝脏中TG含量增加［22］。结果表明，模型对照组TG水平高于空白对照组、阳性对照组和实验组，差异有统计学意义（P＜ 0.01）。TONG等［23］研究表明，酒精引起的肝脏脂肪变性包括细胞溶质脂滴内过多的脂肪积聚，主要是TG。这表明模型构建符合要求；实验组TG水平与阳性对照组差异无统计学意义（P＞0.05），这表明坎地沙坦酯对酒精诱导的肝细胞损伤有保护作用。肝细胞膜结构和功能受损后，ALT和AST溢出，大量渗透到血液中，增加血清ALT和AST［24］。在一定程度上反映了肝细胞损伤的程度。因此，血清ALT和AST升高被认为是判断肝损伤严重程度的重要且敏感指标［25］。结果表明，模型对照组ALT和AST水平高于空白对照组、阳性对照组和实验组，差异具有统计学意义；实验组ALT和AST水平无明显差异。上述结果表明，坎地沙坦酯对酒精诱导的肝细胞损伤具有显著的保护作用。

TGF-β1是一种多功能细胞因子，在细胞生长分化、细胞外基质合成及损伤修复中发挥重要作用［26］。在哺乳动物体内，TGF-β分子主要含有TGF-β1、TGF-β2和 TGF-β3 3种分子亚型。其中TGF-β1是目前公认的最重要的促纤维化因子之一［27］。研究［28］证实，TGF-β1 参与所有肝纤维化病理过程的关键环节。实验结果表明，与空白对照组比较，模型对照组TGF-β1蛋白表达水平和TGF-β1 mRNA水平均显增高，差异具有统计学意义；此外，模型对照组TGF-β1蛋白表达水平和TGF-β1 mRNA水平显著高于阳性对照组和实验组，差异具有统计学意义；阳性对照组和实验组TGF-β1蛋白表达水平和TGF-β1 mRNA水平无明显差异。上述结果表明，坎地沙坦酯能够降低ALF小鼠模型肝脏中TGF-β1的表达，从而发挥抗肝纤维化作用。

Smad转录因子是TGF-β细胞因子家族的关键介质，Smad蛋白的可逆磷酸化在调节其功能过程中发挥关键作用［29］。参与TGF-β信号途径的受体激活型Smads（Smad2和Smad3）可直接丝氨酸化与TGF-β 结合的 TGF-β RI末端羟基集团［30］，TGF-β RI介导的Smad3和Smad2的磷酸化诱导共有配体Smad4与它们结合，然后移位到细胞核内激活特定的基因转录而发挥调节作用［30］。结果表明，模型对照组Smad3蛋白表达水平和Smad3 mRNA水平显著高于空白对照组、阳性对照组和实验组，差异具有统计学意义；阳性对照组Smad3蛋白表达水平和Smad3 mRNA水平与实验组无明显差异。实验结果表明，坎地沙坦酯可以降低AFL小鼠肝组织Smad3的表达，从而改善肝纤维化。

综上所述，坎地沙坦酯能够改善ALF小鼠肝组织炎性浸润、出血、坏死和纤维化程度，降低ALF小鼠血清ALT、AST和TG水平，并降低TGF-β1和Smad3的表达。坎地沙坦酯改善ALF的作用机制可能与抑制TGF-β1/Smad3信号通路有关，明确坎地沙坦酯改善肝纤维化的具体机制需进一步研究。