棉铃虫几丁质合成酶1基因的时空表达分析及氟啶脲对其表达的影响

台术蕾,马 龙,张春妮

(西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌 712100)

几丁质(Chitin)是由N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetyl glucosamine, GlcNAc)聚合而成的多糖单分子聚合物，是无脊椎动物外壳以及真菌藻类细胞壁的重要组成成分，在个体生命活动中发挥着重要的作用(Merzendorfer and Zimoch, 2003; Merzendorfer, 2011; Wangetal., 2012; Tetreauetal., 2015)。在昆虫中，几丁质是表皮、气管以及中肠围食膜等结构的重要组成物质(Merzendorfer, 2006，2011)。几丁质合成酶(chitin synthase, CHS)主要作用于几丁质代谢过程，对昆虫生长发育发挥关键作用。它与几丁质降解酶系共同作用，维持昆虫几丁质水平的动态平衡(Kramer and Koga, 1986；樊东等，2005；刘晓健等，2014)。

目前研究发现，昆虫中的几丁质合成酶主要由几丁质合成酶1(CHS1)和几丁质合成酶2(CHS2)两个基因编码，二者存在于同一条染色体上，可能从同一祖先的基因复制进化而来(Zimoch and Merzendorfer, 2002; Arakaneetal., 2004; Hogenkampetal., 2005; Merzendorfer, 2006；张文庆等，2011；刘晓健等，2014)。CHS1和CHS2基因在昆虫体内具有不同功能，其中CHS1基因主要负责外胚层相关细胞如气管细胞的几丁质合成，其在气管和表皮等组织中高度表达，而CHS2基因则参与围食膜细胞中几丁质的合成，主要在昆虫中肠上皮细胞中表达(Tellametal., 2000; Gagouetal., 2002; Devineetal., 2005; Zimochetal., 2005; Hogenkampetal., 2005; Merzendorfer, 2006；张文庆等，2011；刘晓健等，2014)。有研究表明，果蝇DrosophilamelanogasterDmCHSA在幼虫蜕皮和成蛹过程中表达量很高(Gagouetal., 2002)。烟草天蛾Manducasexta中，MsCHSA在幼虫蜕皮期和蛹中期表达较高(Zhuetal., 2002)。

氟啶脲(chlorfluazuron)是一种苯甲酰基脲类杀虫剂(benzoylphenylureas insecticides, BUPs)，作用于害虫的几丁质合成过程(杨光富等，1999；杨惠和张金桐，2001；米娜等，2009；马龙等，2014)，对鳞翅目害虫具有较好的防治效果。由于几丁质合成酶是昆虫生长发育过程中的关键性酶(刘晓健等，2014)，其作为苯甲酰基脲类杀虫剂的潜在药物靶标一直备受关注(Merzendorfer and Zimoch, 2003；刘晓健等，2010)。棉铃虫Helicoverpaarmigera(Hübner)属于鳞翅目夜蛾科，是重要的世界性农业害虫之一；不仅严重影响棉花生产，还可危害十字花科、豆科、茄科甚至禾本科植物(Martinetal., 2005)。目前尚未有关于棉铃虫几丁质合成酶功能研究的报道。为此，本研究以棉铃虫为研究对象，通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, RT-qPCR)分析方法明确棉铃虫几丁质合成酶基因1(HaCHS1)在不同的发育时期和组织的表达情况，测定了苯甲酰基脲类杀虫剂氟啶脲对棉铃虫HaCHS1表达水平的影响，以期为研究棉铃虫HaCHS1基因的功能研究奠定良好的基础，同时为棉铃虫生长发育过程中机制的探索及基于几丁质合成途径中关键靶点的新药研发提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

棉铃虫敏感品系由本实验室采用人工饲料饲养，饲养条件：温度27±1℃，相对湿度70%±5%，光照周期(L ∶D)为16 h ∶8 h，用10%蜂蜜水供给成虫营养。

1.2 棉铃虫几丁质合成酶基因1的克隆

按照RNAiso Plus(TaKaRa)试剂说明书，对棉铃虫3龄幼虫进行总RNA的提取，取1.0 μg总RNA作为模板，按照PrimeScriptTM1stStrand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)试剂盒说明书，反转录合成cDNA第一链。

采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification cDNA ends, RACE)技术，基于实验室前期获得的棉铃虫几丁质合成酶1基因片段序列，分别在3′端设计特异性上游引物CHS1-3F1(5′-TGAGCC AATCGGTTTAGTGTTCGTGT-3′)和CHS1-3F2(5′-ACGATTATGACAACGACTCGGGCTC-3′)，然后分别与3′ RACE扩增中的锚定引物3 R-outer和3 R-inner组合，进行巢式PCR，获得HaCHS1基因3′端cDNA序列。在5′端设计特异性下游引物CHS1-5R1(5′-CGTGAAAGCAAGCCAAGTATCG-3′)和CHS1-5R2(5′-CCACATCCACGCCACTCGCTCT-3′)，分别与5′ RACE实验中的接头引物5 R-outer和5 R-inner组合，进行巢式PCR，获得HaCHS1基因5′端cDNA序列。将测序获得的3′端片段、5′端片段及中间保守区域序列由Contig Express(http://www.invitrogen.com)软件重新组装后获得棉铃虫几丁质合成酶1基因全长cDNA序列。根据这段序列设计引物ORF1(5′-AACATGGCGACGTCGGG AGG-3′)和ORF2(5′-CATTTAAAATCTACCCT GGAAGG-3′)用于ORF序列的验证。PCR扩增程序：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸5 min，35个循环，72℃延伸10 min。扩增产物经凝胶回收后与pMD-18T载体连接，转化感受态细胞DH5α，菌落PCR鉴定正确后进行测序。

1.3 生物信息学分析

采用在线软件ProtParam(http://web.expasy. org/protparam/)对蛋白质的分子量和等电点进行预测；利用SignalP-4.0 Server(http://www.cbs. dtu.dk/service/SignalP/)和NetNGlyc(http://www.cbs.dtu.dk/services/Net NGlyc/)分别对信号肽结构和糖基化位点进行分析；运用TMHMM 2.0 Server软件(http://www.ch.embnet.org/)分析蛋白质跨膜区；采用NCBI在线工具BLAST(http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi)对蛋白质进行同源搜索；应用MEGA 5.05软件Neighbor-Joining法进行系统进化关系的分析。

1.4 HaCHS1基因在不同发育时期和组织中的表达

1.4.1RNA提取与cDNA合成

收集生长状况良好且虫体大小均一的1龄、2龄幼虫、3～6龄的第1～3天幼虫、预蛹期及第1、2和3天蛹，共3个生物学重复。另外，取棉铃虫6龄中期幼虫15～20头，借助体视显微镜在生理盐水中迅速解剖，分离棉铃虫头部、马氏管、气管、中肠、表皮和脂肪体等组织，共3个生物学重复。材料收集后立即放于液氮中冷激，后保存于-80℃冰箱备用。

按照RNAiso Plus(TaKaRa)试剂说明书，对各组样品进行总RNA的提取及纯化，取1.0 μg总RNA作为模板，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)试剂盒说明书，反转录合成cDNA第一链。

1.4.2实时荧光定量PCR检测

根据获得的棉铃虫HaCHS1a基因序列设计RT-qPCR特异性引物CHS1-QF：5′-GGTTTAGTGT TCGTGTTTT-3′和CHS1-QR：5′-GCATTCTTATCTA GCAGAGC-3′。同时以EF-1α(GenBank登录号：AY325496)为内参基因。20 μL反应体系：10×cDNA模板2 μL，上下游引物各0.5 μL(10 mM)，2×Ultra SYBR Mixture 10 μL，7 μL ddH2O。反应在iQ 5实时定量PCR仪(美国伯乐公司)上进行，PCR反应条件为：95°C 10 min；95°C 15 s，52°C 30 s，72°C 30 s，共40个循环；根据熔解曲线，确定引物及扩增特异性。实验设置3个生物学重复，并进行3次技术重复。RT-qPCR的检测结果采用Ct值的相对定量法(2-ΔΔCt)计算基因的相对表达量(Livak and Schmittgen, 2001)。

1.5 氟啶脲对HaCHS1基因表达的影响

实验室前期数据计算得出氟啶脲LC10为60 mg/L。参照马龙等(2014)的方法：挑选大小一致、生长状态良好的棉铃虫3龄中期幼虫，饥饿处理8 h，随后将试虫在氟啶脲LC10(60 mg/L)药剂中直接浸药10 s取出，放于干净的滤纸上吸干药液，随后放入饲养盒中饲喂新鲜的饲料。以0.1%吐温处理作为对照，设3组生物学重复，每组15头试虫。饲喂处理24 h、48 h、72 h后分别收集对照组和处理组棉铃虫，然后提取整虫RNA，进行cDNA第一链的合成及实时荧光定量PCR检测，具体方法和步骤同1.4.1和1.4.2。

1.6 数据分析

试验数据以“平均值±标准误(SE)”表示。采用SPSS 17.0软件对时空表达试验数据进行单因素方差分析；用studentt-test方法对药剂处理前后的表达数据进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 HaCHS1基因的生物信息学分析

通过RT-PCR和RACE技术克隆获得棉铃虫HaCHS1基因全长cDNA序列(GenBank登录号：MK568465)。HaCHS1全长为5 247 bp，ORF为4 698 bp，编码1 565个氨基酸，5′非翻译区为168 bp，3′非翻译区为381 bp。使用在线软件ExPASy分析发现棉铃虫HaCHS1蛋白的理论分子量为180.7 kDa，等电点(pI)为6.50，预测分子式为C14203H23710N4698O5937S1002；使用TMHMM 2.0 Server软件对其进行跨膜区分析，发现HaCHS1具有16个跨膜螺旋(图1)，故推测HaCHS1为跨膜蛋白。HaCHS1存在3个结构域：结构域A位于N端，包含9个跨膜螺旋；结构域B在中心区，其含有两个标签序列EDR和QRRRW，并且含有两个其他的保守序列CATMWHET和QMFEY；结构域C位于C端，包含7个跨膜螺旋和另一个标签序列SWGTR。用NetNGlyc软件对HaCHS1可能存在的N糖基化位点进行预测，结果显示，HaCHS1中存在6个N-糖基化位点(NVTL、NISS、NWTS、NDSD、NITY和NISV)，分别位于第359、905、944、1 191、1 306和1 518位氨基酸(图1)。利用软件SignalP-4.0 Server进行信号肽预测，发现该蛋白不存在信号肽结构。

图1 棉铃虫HaCHS1基因cDNA序列及推断的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of HaCHS1 cDNA from Helicoverpa armigera注：起始密码子(ATG)与终止密码子(TGA)用黑色着重标示，跨膜区域用阴影部分标示，预测的保守区域用方框标示，下划线表示糖基化位点。Note: The start codon (ATG), stop codon (TAA) and putative polyadenylation signal (ATTAAA) are highlighted in black. The 16 hydrophobic, transmembrane α-helices predicted by TMHMM Server v.2.0 are shaded. The potential conserved motifs are in box. The 6 putative N-glycosylation sites predicted by PROSCAN are underlined.

2.2 HaCHS1基因的同源性比对及分子系统发育分析

利用ClustalW软件将棉铃虫HaCHS1基因与NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中已公布的部分昆虫的CHS1基因的氨基酸序列进行同源比对分析，结果表明HaCHS1与已知的CHS1基因的氨基酸序列同源性为66%～99%，其中与美洲棉铃虫HelicoverpazeaHzCHS1a和HzCHS1b的氨基酸序列同源性最高。

从NCBI数据库中选取具有代表性昆虫物种的10种几丁质合成酶氨基酸序列，利用ClustalX软件进行完全比对后，再用MEGA 6.06软件中的Neighbor-Joining方法进行分子系统进化分析，分析得到的昆虫几丁质合成酶基因分子进化树(如图2)。从系统发育树的结果可以看出，几丁质合成酶基因被分为两支，即几丁质合成酶1(CHS1)和几丁质合成酶2(CHS2)。所有鳞翅目昆虫的几丁质合成酶1(HaCHS1、HzCHS1、SeCHS1、MsCHS1和PxCHS1)形成了一个亚分支，其中HaCHS1与美洲棉铃虫、甜菜夜蛾Spodopteraexigua(Hübner)、烟草天蛾Manducasexta和小菜蛾Plutellaxylostella几丁质合成酶1亲缘关系较近，这与传统上的分类一致。

图2 基于氨基酸序列构建的棉铃虫及其他昆虫几丁质合成酶基因CHS的分子进化树Fig.2 Phylogenetic tree based on the amino acid sequences of insect chitin synthases注：所选生物物种的几丁质合成酶基因序列包括冈比亚按蚊Anopheles gambiae (AgCHS1, XP_321336), 意大利蜜蜂Apis mellifera (AmCHS1, XP_395677; AmCHS2, XP_001121152), 黑腹果蝇Drosophila melanogaster (DmCHS1, NP524233; DmCHS2, NP001137997), 丝光绿蝇Lucilia cuprina (LcCHS1, AAG09712), 烟草天蛾Manduca sexta (MsCHS1, AAL38051; MsCHS2, AAX20091), 小菜蛾Plutella xylostella (PxCHS1, BAF47974), 甜菜夜蛾Spodoptera exigua (SeCHS1, AAZ03545; SeCHS2, ABI96087), 斜纹夜蛾Spodoptera frugiperda (SfCHS2, AAS12599), 赤拟谷盗Tribolium castaneum (TcCHS1, AAQ55059; TcCHS2, AAQ55061), 美洲棉铃虫Helicoverpa zea (HzCHS1, ADX66429).

2.3 HaCHS1基因在棉铃虫不同发育时期和组织中的表达分析

选取1龄、2龄幼虫、3～6龄第1～3天幼虫、预蛹期及第1、2和3天蛹，对HaCHS1基因的表达进行了分析，发现HaCHS1基因在4龄～5龄幼虫的中期表达量较低，而在前期或后期表达量较高；在预蛹期表达量最低，在蛹期第一天表达量达到最高，随后逐渐降低(图3)。

图3 几丁质合成酶1基因(HaCHS1)在棉铃虫不同发育时期的相对表达量Fig.3 Relative expression levels of chitin synthase 1 gene (HaCHS1) in different developmental stages注：以表达量最低P0为1；1L，1龄幼虫；2L，2龄幼虫；3L1，3龄幼虫第1天；3L2，3龄幼虫第2天；P0，预蛹期；P1，蛹期第一天。柱状图上不同的小写字母表示5%水平差异显著(Student-Newman-Keuls (SNK)单因素方差分析)。Note: The relative expression was calculated based on the value of the lowest expression which was ascribed an arbitrary value of 1. The age in days of the insects is indicated, e.g., 1L, first-instar larvae; 2L, second-instar larvae; 3L1, first day of third-instar larvae; 3L2, second day of third-instar larvae; P0, the stage of prepupae; and P1, first day of pupae. Different lower-letters above the bars indicate significant differences (P<0.05, Student-Newman-Keuls (SNK) in one way ANOVA).

对棉铃虫6龄中期幼虫不同组织HaCHS1基因表达量进行检测，结果表明(图4)，HaCHS1基因在头部表达量最高，其次是表皮，而在中肠、气管、马氏管和脂肪体中的表达量均极低。

图4 几丁质合成酶1基因(HaCHS1)在棉铃虫不同组织相对表达量Fig.4 Relative expression levels of HaCHS1 in different tissues of Helicoverpa armigera注：以组织最低表达量为1；IN，MG，HE，TR，MT和FB分别表示表皮、中肠、头部、气管、马氏管和脂肪体；柱子表示平均值±SE，3个生物学重复；不同的字母表示差异显著(P<0.05，Student-Newman-Keuls (SNK)单因素方差分析)。Note: Expression levels in integument (IN), midgut (MG), head (HE), trachea (TR), malpighian tubules (MT) and fatbody (FB) were detected by qPCR. Different letters above the bars indicate significant differences (P<0.05, Student-Newman-Keuls (SNK) in one way ANOVA).

2.4 氟啶脲对棉铃虫几丁质合成酶基因 HaCHS1表达的影响

用LC10浓度(60 mg/L)氟啶脲药剂处理棉铃虫3龄中期幼虫，利用RT-qPCR对处理后不同时间试虫体内的HaCHS1基因表达水平进行测定，结果发现(图5)：氟啶脲处理后HaCHS1基因呈现出“抑制-激活-再抑制”的作用。处理后24 h和72 h，HaCHS1表达水平显著低于对照(P<0.05)，而在处理后48 h，处理组HaCHS1表达水平则显著高于对照(P<0.05)。

图5 氟啶脲处理棉铃虫3龄幼虫后不同时间HaCHS1基因相对表达量Fig.5 Relative expression levels of HaCHS1 after exposure to chlorfluazuron注：表达量最低为1；柱子上的*表示处理组与对照组相比显著差异P<0.05(Student t-test检验)。Note: The lowest expression is ascribed an arbitrary value of 1; * on the column indicates a significant difference between the treatment group and the control group (P<0.05, Student t-test).

3 结论与讨论

几丁质合成酶(CHS)是参与几丁质生物合成过程的重要酶类，是几丁质合成途径最后一步的关键酶，在生物体中尤其在昆虫生长发育等方面发挥着重要作用。本研究克隆获得棉铃虫HaCHS1基因cDNA序列，HaCHS1全长为5 247 bp，ORF为4 698 bp，编码1 565个氨基酸，预测HaCHS1存在16个跨膜区。烟草天蛾ManducasextaMsCHS1基因编码1 564个氨基酸，预测存在16个跨膜螺旋(Zhuetal., 2002)。昆虫几丁质合成酶基因跨膜螺旋的数目(15～18)比真菌(5～7)多，推测这些丰富的跨膜螺旋可能参与了几丁质的转运过程(Zhuetal., 2002; Tellametal., 2000)。HaCHS1存在3个结构域。结构域A位于N端，包含9个跨膜螺旋。不同昆虫结构域A具有不同数量的跨膜螺旋结构，序列相似性最小。跨膜螺旋的数量决定N端位于膜的不同侧面，面向细胞外环境或细胞质(Merzendorfer and Zimoch, 2003)。HaCHS1结构域B在中心区，包含两个独特的标签序列，EDR和QRRRW，它们存在于所有类型的几丁质合成酶中，是催化机制中必不可少的(Merzendorfer and Zimoch, 2003; Tellametal., 2000)；结构域C位于C端，包含7个跨膜螺旋和另一个标签序列SWGTR，具有较小的序列相似性。

昆虫的CHS1表达具有明显的组织特异性。甜菜夜蛾SeCHS1主要在表皮、气管和中肠组织表达，而在脂肪体和马氏管表达量很低或几乎没有表达(Chenetal., 2007)。梨小食心虫GrapholithamolestaGmCHS1主要在体壁、头部和气管中表达，在中肠中的表达量远低于体壁(杨静等，2017)。通过RT-qPCR对棉铃虫不同组织HaCHS1基因表达进行了检测，结果发现该基因主要在棉铃虫表皮和头部组织中表达，而在中肠、气管、脂肪体和马氏管等其他组织中表达量很低，结果与先前在东亚飞蝗Locustamigratoriamanilensis(刘晓健，2010；Zhangetal., 2010)、烟草天蛾(Hogenkampetal., 2005)和赤拟谷盗Triboliumcastaneum(Arakaneetal., 2005)中的研究是一致的。

在甜菜夜蛾中，SeCHS1基因在预蛹期表达量较低，而进入蛹期以后表达量又显著增加(Chenetal., 2007)。此外，在玉米螟Ostriniafurnacalis中也呈现出一致的结果(Qu and Yang, 2011)。本研究结果表明，HaCHS1在4龄和5龄幼虫的前期或后期表达量较高，而在中期表达较低。在预蛹期表达量最低，但进入蛹期之后表达量急剧上升，且蛹期第一天表达量最高。这就说明HaCHS1在棉铃虫蜕皮过程以及从幼虫期向蛹期变态转化过程中起着重要的作用，可能参与棉铃虫变态过程中几丁质的合成(Arakaneetal., 2004; Ampasalaetal., 2011；张文庆等，2011)。Arakane等(2005)报道利用RNA干扰(RNA interference, RNAi)沉默赤拟谷盗TcCHS1基因后，在幼虫到下一龄幼虫阶段、幼虫化蛹阶段以及蛹羽化为成虫阶段的蜕皮都受到不同程度的影响。抑制中华稻蝗Oxyachinensis的CHS1基因表达后，导致其蜕皮时间延迟，出现不能正常完成蜕皮过程或部分个体腹部皱缩致死的现象(余志涛等，2012)。利用RNAi技术抑制甜菜夜蛾CHS1基因表达后，导致幼虫出现蜕皮障碍、新的几丁质层不能正常形成或气管发育畸形现象(Kramer and Koga, 1986; Chenetal., 2008)。

苯甲酰基脲类杀虫剂能干扰靶标害虫的几丁质合成过程，抑制虫体内几丁质的合成，从而导致害虫死亡或不育。研究表明，氟虫脲(flufenoxuron)能够上调东亚飞蝗和中华稻蝗中CHS1基因的表达水平(刘晓健等，2010)。然而，氟啶脲处理后小菜蛾CHS1基因表达没有显著变化(Ashfaqetal., 2007)，可能与药剂处理后促进了蜕皮期间表皮的分离和消化有关(Xiaetal., 2014)。本研究结果表明，氟啶脲在亚致死浓度(60 mg/L)下对棉铃虫HaCHS1基因呈现出“抑制-激活-再抑制”的作用。此外，除虫脲diflubenzuron 能够显著提高四斑按蚊Anophelesquadrimaculatus(Zhang and Zhu, 2006)、大豆芽Aphisglycines(Bansaletal., 2012)和褐色橘蚜Toxopteracitricida(Shangetal., 2016)中CHS1的表达水平，但对果蝇(Gangishettietal., 2009)和赤拟谷盗(Merzendorferetal., 2012)的CHS1基因表达没有影响。除虫脲处理后，四斑按蚊几丁质合成酶活性降低，导致几丁质含量减少，CHS1基因表达增加可能是昆虫体内一种补偿酶含量减少的反馈调节机制(Zhang and Zhu, 2006)。由于几丁质生物合成过程严密复杂，昆虫生长调节剂对其生物合成机制的影响还需进一步研究。