昆虫对环境低氧的适应：生理和分子机制研究进展

芦 超，丁 玎，陈 兵*

(1. 河北大学生命科学学院，河北保定 071002；2. 中国科学院动物研究所，北京 100103)

氧是机体进行新陈代谢和维持生存的必要因素。人们了解氧对动物生命的至关重要性始于1774年，然而直到20世纪90年代，人们才开始探索氧缺少对动物的影响。世界上存在许多低氧分压的环境，例如高海拔地区、深海，这类环境严重影响着动植物的生存与发展，同时低氧也是许多疾病发病过程中的一个重要的环境因素。许多野生动物都能够在这样的极端环境下长期很好的生存和繁殖，说明在世代居住的过程中动物都进化出了相同或者特异的方式去适应低氧环境。

无脊椎动物尤其是昆虫因其较好的可操作性以及其本身生理特点，很早就被人类用于低氧适应的研究。昆虫是世界上种类和数量最多的动物，其生活环境非常多样。由于栖息地处于恒定低氧(如高海拔地区、寄主的胃部)和间断低氧或无氧(如洪水淹没和冰雪覆盖地区、腐肉、果实或密闭的容器)的条件，它们发展出了各自的适应策略求得生存和繁荣壮大。长久以来对于昆虫低氧的研究取得了一系列成果，在生态、进化和基础医学等领域都受到了广泛的关注，本文就昆虫在不同方面对于低氧环境的适应做了综述。

1 昆虫的呼吸和携氧系统及其低氧适应

1.1 昆虫的低氧耐受能力

由于昆虫的广泛分布，它们的栖息地包括陆地、水中以及高海拔地区，在这些栖息地中，昆虫都会面临不同的低氧环境。它们的种类涉及到了大部分昆虫类群，包括鞘翅目Coleoptera、双翅目Diptera、鳞翅目Lepidoptera、等翅目Isoptera、弹尾目Collembola和直翅目Orthoptera。在实验室极度低氧或无氧条件下，这些昆虫能够存活数十分钟、数天甚至数月(Hoback and Stanley, 2001)。

对于栖息在陆地的昆虫，土壤、粪便、谷物堆，或被淹没的洞穴等地方经常产生低氧环境(Hoback and Stanley, 2001)，所以不同栖息地的昆虫在其生命阶段需要具有一些能够应对环境低氧的适应能力，从而提高他们的生存率(Hoback, 2012; Campetal., 2014; Harrison, 2015)。如蜣螂生活在充满粪便的洞穴当中，它们要面临低氧和体内二氧化碳过多的危害，因此蜣螂新陈代谢所需要的临界氧分压(partial pressure of oxygen,PO2)十分低(Holter and Spangenberg, 1997)。但同样在洞穴中筑巢的蜜蜂Megachilerotundata的新陈代谢所需要的临界PO2值与其他昆虫相似(Owingsetal., 2014)。处于不同发育阶段的昆虫对于低氧的耐受能力也存在差异，比如烟草天蛾Manducasexta的蛹比其5龄幼虫更容易在洪水中幸存(Woods and Lane, 2016)，但对于毛翅蝇Ironoquiaplattensis来说，它的蛹比幼虫更容易受到洪水影响(Cavallaro and Hoback, 2014)。除此之外，苹果蠹蛾的卵和成虫在0.5%氧浓度的常压低氧条件下只能存活1.25 h，而其滞育幼虫却能存活42 d，其原因可能是滞育期的幼虫对代谢显著抑制从而减少了耗氧(Soderstrometal., 1990)。

水生昆虫比陆地昆虫更容易受到低氧环境的影响，因为氧气在水中的溶解度极低，并且消耗或者产生氧气都会迅速导致水中的PO2值剧烈变化，在较小的水体中这一现象更加明显。使这一情况更加恶劣的另一个原因就是氧气在水体中扩散平衡所需要的时间更多(Dejours, 1975; Verberketal., 2011)。对石蚕蛾Hydropsycheangustipennis的研究表明，它们通过改变自身行为活动时间来克服低氧环境，如增加了自身通气时间以提高体内含氧量，同时降低了捕食等其他活动的时间来减少自身对于氧气的消耗量(Van der Geest, 2007)，在羽摇蚊Chironomusplumosus的研究中也发现了类似的现象(Walshe, 1950)。不同水生昆虫在低氧环境下的生存能力有很大差异，有些仅耐受轻微低氧而有些可以耐受极度低氧。有趣的是，即使是亲缘关系很近的水生昆虫，它们的耐低氧能力也存在差异(van der Geest, 2007; Verberk and Bilton, 2013)。在这些昆虫中，那些具有耐极端低氧的类群，就更容易建立生存优势(Hamburgeretal., 1994)。

生活在高海拔地区的昆虫，随着海拔升高空气密度降低，PO2值也逐渐降低。高海拔低氧可能是影响个体生长和大小的重要原因，但目前相关研究较少(Harrisonetal., 2018)。在许多高海拔地区没有蜜蜂的分布，原因之一可能就是氧气浓度过低无法维持蜜蜂飞行过程的能量代谢(Joosetal., 1997)。但是生活在西藏高原的飞蝗与平原的飞蝗相比对于低氧的耐受性更强，低氧下线粒体损伤较小，电子转运催化效率更高，这些都为飞蝗在高原低氧环境中维持能量代谢提供直接帮助(Zhouetal., 2008)。

储藏物昆虫也是一类特殊的经常遭遇低氧环境的昆虫。对豆象甲Callosobruchuschinensis在低氧(2% O2)和常氧(20% O2)条件下的代谢谱研究表明，豆象甲在低氧条件下会通过改变自身的代谢途径来提高自身低氧耐受性，如激活乙醛酸循环将脂肪酸转发为碳水化合物用于能量代谢(Cuietal., 2017)。储藏物昆虫在不同发育阶段低氧耐受性不同，比如烟草甲Lasiodermaserricorne的幼虫能够忍受氧气浓度低于1.0%～1.3%的极端低氧情况，而其成虫则不能(Imai and Fukazawa, 2012)。绿豆象Callosobruchusmaculatus则卵是对缺氧最敏感的，特别是在早期，而3龄、4龄幼虫是最耐受性最强的，可以在低氧条件下存活15 d(Chengetal., 2015)。

另外也有一些昆虫所具有的无氧耐受能力与栖息地的环境并无关系，例如沙漠飞蝗Schistocercagregaria，虽然世代生活在常氧环境中，却能在无氧条件下生存长达8 h(Hochachkaetal., 1993)，这些预示着昆虫对低氧或无氧的耐受能力可能是普遍存在的。

1.2 昆虫的呼吸系统—气管系统

昆虫的气管系统是连续不断遍布全身的由上皮细胞构成的管状网络。在气管的末端不断分支和细化，深入组织内部直接为组织输送氧气。在胚胎时期，气管系统的一些基础组织开始发育，该发育过程主要受遗传因素传控制。在幼虫期间气管系统成为可塑性组织，可以根据机体对氧气的需求生长和分支。

关于昆虫气管系统对氧气响应的研究主要是以果蝇为模型进行操作的。在发育过程中，果蝇早期气管原基的形成是在胚胎中期开始的，调控该过程的基因为trachealess，该基因编码的蛋白Trh调控一系列基因的转录从而促进气管的发育(Isaac and Andrew, 1996)。随后气管原基形成囊泡，并向上生长，气管细胞随即向上迁移形成六条原始的气管分支(Vincentetal., 1997)。随着分支的不断生长和扩张并逐渐形成网络(Vincentetal., 1997)。纤维原细胞生长因子受体(Fibroblast growth factor receptors，FGFR；在果蝇中FGFR的类似物被称作Breathless (Btl))在气管分支和生长过程中发挥了很重要的作用。FGFR在所有气管细胞中均有表达，而在目标组织，其配体Branchless(Bnl)可引导表达FGFR的气管细胞向其移动，一旦气管细胞移动到含有Bnl的细胞簇，该过程会停止并开始下一轮调控，该过程的不断重复使得气管不断延伸(Sutherlandetal., 1996)。

昆虫气管系统受到氧气浓度调控的现象最早是在猎椿中发现的(Wigglesworth, 1954)。随后又发现，昆虫在感受氧气浓度及调控气管发育过程中，低氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor, HIF)起到了核心的作用。在果蝇中，HIF-α亚基的同源蛋白Sima通过调控Btl的表达来调节气管的分支和生长(Centaninetal., 2008)。

1.3 昆虫的携氧系统—呼吸蛋白

因为昆虫具有发达的气管系统，最初认为呼吸蛋白对于昆虫的氧气传递不是必需的(Rubinetal., 2000; Willmeretal., 2009)。然而随后的研究发现事实并非如此，在生活于马胃部的肤蝇幼虫体内发现了大量的血红蛋白(Hemoglobin)，血红蛋白的存在有利于增强氧气的摄取和输送(Hoback and Stanley, 2001)。随后在黑腹果蝇Drosophilamelanogaster体内发现血红蛋白，果蝇血红蛋白的合成主要与气管系统和脂肪体有关，这表明昆虫体内的氧气供应可能比之前想象的要复杂，除了简单的扩散外，还可能依赖于血红蛋白介导的氧气运输和储存(Hankelnetal., 2002)。

随后在一些昆虫中还发现另一种携氧蛋白即血蓝蛋白(Hemocyanin)(Hagner-Holleretal., 2004)。对石蝇Perlamarginata的研究表明，具有氧结合特性的血淋巴包含血蓝蛋白(Hagner-Holleretal., 2004)。与之相类似，飞蝗Locustamigratoria在胚胎时期，气管系统发育之前，蝗卵和胚胎大量表达血蓝蛋白，血蓝蛋白的缺失会严重影响飞蝗的胚胎发育(Chenetal., 2015)。血蓝蛋白广泛存在于非完全变态昆虫中这一现象的发现，暗示血蓝蛋白对昆虫呼吸可能存在着潜在的意义(Burmester, 2001; Burmester and Hankeln, 2007; Picketal., 2008; Picketal., 2010)，这与血红蛋白在昆虫中可能起到辅助运输氧气的推测吻合。

血蓝蛋白的表达仅限于胚胎中晚期和1龄若虫，如在杜比亚蟑螂Blapticadubia和美洲沙漠蝗Schistocercaamericana的胚胎中就是这样，这意味着血蓝蛋白可能进化出一种胚胎中与气体交换或储存相关的特殊功能(Sánchezetal., 1998; Picketal., 2010)。低氧下培养飞蝗胚胎可以大量诱导血蓝蛋白的表达上调，进一步说明血蓝蛋白与环境可获得氧密切相关(Chenetal., 2017)。卵可能是通过胚胎表面转移氧气来调节氧气供应，或者给呼吸组织或局部储存氧气。同时，血蓝蛋白还可能具有与氧转运有关的其他功能，如缓冲胚胎的供氧，控制供氧的时间和强度，或作为向卵壳输出信号的低氧传感器，增加其通气量或增加流入胚胎的氧气量(Chenetal., 2015)。

对于昆虫呼吸蛋白的研究主要集中在胚胎时期，而且呼吸蛋白的存在也主要在昆虫的胚胎时期，这主要可能是因为胚胎时期的昆虫幼虫由于没有成熟的呼吸系统—气管系统来运输氧气，所以在漫长的进化过程中选择了呼吸蛋白来辅助呼吸。相反的，当昆虫进入成虫期时，气管系统逐渐成熟，无论是效率还是实用性都高于呼吸蛋白，所以在昆虫成虫时期不再表达呼吸蛋白。基于此，陈兵等人提出了胚胎期血蓝蛋白表达和气管系统发育的互补模型(Chenetal., 2017)，该模型很好解释了昆虫胚胎呼吸的机制。该发现也说明昆虫的不同发育阶段应对低氧环境的方式可能是具有差异的。基于西藏飞蝗与平原飞蝗胚胎中血蓝蛋白的比较研究进一步揭示了血蓝蛋白在低氧适应中的作用，该研究表明，西藏飞蝗胚胎血蓝蛋白含量远远高于平原飞蝗。虽然低氧诱导可以显著提高平原种群和高原种群胚胎的血蓝蛋白表达，但高原种群在低氧刺激下血蓝蛋白表达更为稳定(Chenetal., 2017)。因此，较高的血蓝蛋白含量可能有助于西藏飞蝗胚胎在低氧高海拔地区更好地获得充足和稳定的氧气供应。

2 昆虫低氧研究体系与方法的发展

获得耐低氧昆虫品系是研究昆虫低氧适应的前提和基础，因此筛选具有耐低氧性的昆虫品系是研究昆虫低氧适应的一个重要步骤，这种筛选可以是实验室人为选择筛选出来的，也可以是在自然界低氧环境中长期自然选择而筛选出来的。有研究者将黑腹果蝇D.melanogaster培养在逐步降低O2水平的环境中，经繁殖超过200代后，通过这样的人工筛选获得了能够忍受严重低氧的果蝇种群，其可以忍耐极端低氧的特性可以遗传，即使在没有低氧压力的情况下，这种耐受性仍然存在(Zhouetal., 2011)。除此之外，青藏高原是天然的低氧环境，生活在青藏高原的昆虫必然经历了长久的自然选择。在对西藏飞蝗的研究中发现，西藏飞蝗的体型明显小于平原飞蝗，更有利于氧气的输送；在低氧情况下，西藏飞蝗的呼吸频率也明显高于平原飞蝗；经过极端低氧处理(1.6 kPaPO2)西藏飞蝗在极端低氧条件下的晕倒率远远低于平原飞蝗(Zhangetal., 2013)；种群分化历史研究表明在10 000年前左右两个种群的基因交流水平降到了最低值(Dingetal., 2018)。这些结果说明西藏飞蝗是经历自然选择而得到的具有耐低氧性的昆虫品系。

基因表达研究是昆虫低氧适应研究中重要的一部分，通过基因表达研究，可以得到低氧处理后实时的基因表达变化，基因表达研究的方法有很多，包括DNA微阵列(DNA microarray)、转录组、代谢组等多种方法。有研究者使用DNA微阵列技术对人工培育出的耐极端低氧的果蝇品系进行了研究，得到了一系列受到抑制的代谢基因，并发现作为代谢开关的hairy基因(详见5)(Zhouetal., 2008)。该方法同样被应用在飞蝗L.migratoria当中，推测出在极端低氧下飞蝗受到的主要威胁不是能量危机，而是氧化损伤(详见3.3)(Zhaoetal., 2012)。转录组研究能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息。如使用转录组技术比较了果蝇暴露于轻度低氧(4～5 kPaPO2)和严重低氧(1.5～0 kPaPO2)下1～6 h后的转录反应，证明昆虫在重度低氧时主要转向损伤控制(Lietal., 2013)。代谢组学是对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式，也被广泛应用于昆虫低氧适应研究。有研究者通过对栖息于高山地区的小金蝠蛾Thitarodesxiaojinensis代谢组学研究，发现其通过引起体内氧浓度下降来实现热应激反应(详见5)(Zhuetal., 2019)。

全基因组重测序是现今比较常用的遗传变异研究方法，如通过比较不同种群的基因组发现种群间的遗传差异；对基因组的多态性和杂合度的分析，确定种群是否受到自然选择压力；分析固定指数和杂合度等指标确定种群中与低氧适应相关的受选择基因；对这些基因进行功能富集和信号通路富集，从而获得与低氧适应相关的富集通路。这一系列分析方法可以很恰当的解决所要研究的低氧适应遗传机制。有研究者就通过对西藏蝗虫和平原蝗虫进行基因组重测序发现，胰岛素通路中蛋白酪氨酸磷酸酶非受体1型(Tyrosine protein phosphatase non-receptor type 1, PTP1B)在西藏蝗虫中受到选择，与低氧代谢适应相关(详见6.1)(Dingetal., 2018)。也有研究者比较了非洲东部栖息于不同海拔的同种蜜蜂的基因组，发现高海拔地区蜜蜂基因组中7号染色体和9号染色体上有区域受到了正向选择，从而影响其低氧行为适应(详见6.3)(Wallbergetal., 2017)。

3 低氧适应的生理机制

3.1 气体交换模式的改变

气孔是位于昆虫体表调控氧气进出机体的小孔，在面对低氧环境时，氧气含量调控了昆虫气孔的闭合频率和持续时间。研究表明当周围氧气浓度降低时，气孔会延长张开时间、增加张开频率。同时气孔也是机体排出二氧化碳的气管，因此低氧也会造成暂时性的二氧化碳和呼吸作用产的水排放增多等特点(Frazieretal., 2001)。后续又有研究者报道，气孔在进行气体交换调控时可分为3种状态：开启状态(大量释放二氧化碳)、闭合状态、煽动状态(少量释放二氧化碳)。在面对低氧环境时，气孔闭合状态持续时间明显缩短，同时煽动状态时二氧化碳排放量增加。除此之外，闭合状态的持续时间与周围氧分压成正比，这个结论进一步证明调控气孔开闭频率与持续时间是周围环境的氧分压而非气管系统本身的氧分压(Hetz and Bradley, 2005)。

3.2 通气量的改变

低氧环境中机体的通气量会显著增加，然而过高的氧气含量对通气量无明显影响。已有的研究认为低氧环境中通气量的增加可能是由于二氧化碳增加导致的，另外一个原因也可能是活性氧积累(Deanetal., 2004)。在对黄粉虫Tenebriomolitor的研究发现，在15%和10.5%氧浓度的常压低氧条件下，气管横截面积分别增长了40%和120%，以此来增加自身通气量来适应低氧环境(Hoback and Stanley, 2001)。但是长期处于低氧环境中，通气量调控的敏感度则显著降低，有研究发现长期处于不同氧气浓度(PO2分别为：5、10、21、40 kPa)环境中饲养的蝗虫的通气之间无明显差别，与此同时，测量发现腹部呼吸的幅度和频率也无明显差异(Harrisonetal., 2006)。而将处于低氧环境中饲养的蝗虫放置在正常氧浓度环境下测量，其通气量则显著降低。这个结果表明为了适应长期低氧环境，蝗虫显著的降低了自身的通气量。

3.3 抗氧化损伤能力改变

与哺乳动物或鸟类不同，昆虫可以在无氧条件下存活数小时甚至数天之久，同时只会对机体造成轻微的损伤。在脊椎动物中低氧会导致机体分解三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate, ATP)的能力减弱，从而影响后续输氧后的恢复。而在飞蝗的飞行肌的研究中发现无氧环境下其细胞内ATP依然可分解为磷酸腺苷(Adenosine monophosphate, AMP)，而且只有很少一部分会转化成次黄嘌呤、黄嘌呤或者尿酸等副产物(Weyel and Wegener, 1996)。此外，昆虫体内的海藻糖对于其抵抗无氧环境的压力也起到了重要作用，在无氧环境中海藻糖具有防止蛋白变性，保护细胞等作用(Chenetal., 2002)。对于昆虫抗氧化损伤的机制到目前还不是很清楚，而针对昆虫的这一特点的研究有助于我们提高对于人类一些疾病的认识。

在对飞蝗的研究中发现，在低压低氧的环境下，肌细胞中参与能源生产过程的基因在转录水平受到显著抑制，包括丙酮酸脱氢酶作用的脱羧反应、脂肪酸运输和β-氧化过程、TCA循环、电子传递链和ATP合成过程。这些过程的抑制主要是由于一些关键步骤的基因表达受到了抑制。之后研究者又通过通路研究分析，结果显示糖酵解和其下游的各个途径均受到了明显的抑制，相反的戊糖磷酸途径却表现出明显的增强。这表明能量产生过程的抑制和戊糖磷酸途径的增强协同地将葡萄糖从合成ATP转移到产生还原力，对于这一现象有一种可能的解释便是在低压低氧中，主要的威胁不是能量危机，而是氧化损伤(Zhaoetal., 2012)。因此，在低氧情况下，对于葡萄糖的分流和重新分配也是一种抗氧化损伤的适应。也有研究者对果蝇在有氧代谢率临界PO2范围内(4～5 kPaPO2)和严重低氧(0～1.5 kPaPO2)范围内的转录组进行了测序研究。比较了暴露于0.5 kPaPO2的严重低氧下1 h和6 h后的转录反应，结果表明许多基因(如热休克蛋白)的表达随时间增加而增加，更多的基因随着暴露时间的延长而上调(Lietal., 2013)。而在轻度低氧环境中诱导的基因(主要是转录因子和编辑基因)较少，且不包括热休克蛋白，这与前面飞蝗在重度低氧时主要转向损伤控制的假设一致。

4 发育和体型的适应

4.1 体型与氧气浓度的关系

在动物进化过程中，PO2水平发生了巨大的变化，许多研究结果表明昆虫体型的变化与环境氧浓度变化有关。化石和地质证据表明，PO2水平的增加与动物体型的增加有关，这就导致了一种假说，即古生代晚期著名的巨型昆虫是由氧气供应的增加而生存的(Harrisonetal., 2010)。有研究者指出在氧浓度大于30%PO2的古生代晚期(Michaud and Denlinger, 2007)，昆虫的体型大小几乎是现在近亲昆虫体型的十倍(Dudley, 1998)。对化石和环境氧浓度的进一步研究表明，在昆虫进化的前150百万年，随着空气中氧浓度的下降，昆虫的翅长逐渐变短(Clapham and Karr, 2012)。这些结果都支持了前面的假说，同时也暗示着昆虫减小自身的体型来适应外界环境氧浓度的降低。

此外，研究人员还发现人工低氧环境下饲养黑腹果蝇和烟草天蛾体型明显缩小(Zhouetal., 2008; Callier and Nijhout, 2011)。在对黑腹果蝇的进一步研究发现，低氧条件下(10 kPaPO2)的种群个体较小，但当这些种群恢复到正常状态时，其大小与正常PO2条件下的饲养的种群相同，这说明低氧对种群个体大小有很强的约束作用。相比之下，在较高氧分压下饲养的果蝇(40 kPaPO2)的体型与常氧状态下的果蝇无明显差异(Klok and Harrison, 2009)。此外，耐受高氧的果蝇成虫的体型也增加了。耐受高氧的果蝇成虫(能够生活在60～90 kPaPO2的成虫)的体重至少比对照组高近20%(McElroy and Chandel, 2017)。与对照组相比，高氧耐受性果蝇的翅面积增大，翅细胞总数也明显增多。这些研究结果再次表明，氧气浓度与昆虫体型确实存在一定关系。对这一现象的一种解释是，体型缩小可能是昆虫对低氧环境的适应的结果之一，因为体型的缩小使昆虫能够以更低的总能量和氧气需求来进行繁殖，并通过减少氧气的扩散距离来提高组织PO2。也有研究人员将其解释为“时效性”，即因为低氧中适宜的食物资源的短时性，促使果蝇发育到成虫减小身体尺寸(Harrison and Haddad, 2011)。另一种解释是由于细胞数量减少，因为果蝇细胞的分裂周期会受到周围低氧环境的严重影响(Wingrove and O’farrell, 1999)。细胞在分裂中期生长停滞或减缓表明有丝分裂期间DNA的复制对氧气非常敏感。在低氧环境中长期饲养的果蝇细胞数量较少，体积较小也证明了上述假设，因此这也被认为是氧气影响昆虫体型大小的原因之一(Peck and Maddrell, 2005)。以上这些结果说明缺氧以被动的、普遍的方式影响新陈代谢，同时诱导靶信号通路的激活，这些信号通路介导了体型的缩小，或者补偿代谢干扰，减弱体型的缩小(Callier and Nijhout, 2014)。

但是氧气浓度对昆虫体型大小的影响也取决于昆虫的种类。对于果蝇D.melanogaster、绿头蝇Calliphoravomitoria、烟草天蛾M.sexta以及黄粉虫T.molitor等，其体型大小与氧气浓度在一定范围内成正相关。而对美洲沙漠蝗的研究发现，长期低氧环境生活并不会影响其最终体型大小(Greenberg and Ar, 1996; Frazieretal., 2001)。

4.2 发育时间与氧气浓度的关系

有研究认为昆虫的临界体型是受到体内氧分压决定的，在幼虫发育期间，随着脂肪体的积累，体型不断的生长，但是在此过程中气管系统及气孔等依然保持恒定，当机体不断增大时会出现组织供氧减少的情况，随即昆虫达到临界体积并开始蜕皮(Woods and Hill, 2004)。迄今的研究中均发现10 kPa或者更低的氧气浓度会延长昆虫的发育时间，减缓昆虫的发育速率。在对烟草天蛾M.sexta的研究表明，较高的发育速率会导致抗应激能力的降低和氧化损伤过多的累积，也就是说在氧气浓度较低的情况下，烟草天蛾会选择降低发育速率从而提高自身抗氧化损伤能力和应激能力来获得更高的生存率(Harrisonetal., 2013)。

最近基于肠道微生物造成的类似低氧环境的研究给我们新的启示。在无肠道微生物群时，给埃及伊蚊Aedesaegypti即使喂食营养全面的食物，它们的发育不会超过1龄，与此相反，包括大肠杆菌在内的几种细菌可以帮助无菌性幼虫发育成成虫。在这种情况下，埃及伊蚊幼虫肠道内的氧气浓度降低到了5%以下，这就说明肠道微生物导致的体内氧分压下降是促进埃及伊蚊生长和蜕皮的重要因素(Coonetal., 2017)。这就进一步证实了“昆虫的临界体型是受到体内氧分压决定的”这一假设。这些研究结果说明，低氧不仅会对昆虫机体造成一定的影响，同时也是昆虫生长发育的必要条件，这对我们理解昆虫对低氧的适应性进化机制有重要意义。

5 代谢适应

对官袍虎甲Cicindelatogata幼虫的研究发现，25℃下的无氧环境中抑制了机体97%的代谢活动，同时其无氧呼吸则显著增强(Hobacketal., 1998)。通过对极端耐低氧品系的果蝇与正常氧分压条件下饲养的果蝇进行比较研究发现，耐低氧果蝇的整体代谢水平受到了明显的抑制(Zhouetal., 2011)。深入研究发现，低氧耐受性较高的果蝇品系体内一个名为hairy的转录抑制因子的转录调控区存在明显的变异，该变异使其所在基因的表达量显著升高，从而抑制了能量代谢相关基因的表达。而将hairy的基因敲除显著降低了果蝇低氧耐受性，使得这些果蝇在低氧环境中的存活率显著降低(Zhouetal., 2008)。同样的，平原飞蝗在温和低氧环境中(13%PO2)的能量代谢过程受到了系统性的抑制(Zhaoetal., 2012)。小金蝠蛾T.xiaojinensis是一种生存温域极窄生物，在面对高温环境时，其通过降低体内氧气浓度来抑制其有氧代谢的整体强度，激活了效率较低的厌氧糖酵解来维持其能量供应，以延长其在高温环境中的生存时间(Zhuetal., 2019)。由此可见，降低自身的代谢过程是对于昆虫的低氧适应是十分重要的一种方式，同时对于某些生物来说低氧又是其适应其他逆境的一种缓冲方式。

然而有趣的是，对于西藏飞蝗转录组的研究显示，能量代谢相关基因表达量则无明显变化，其体内丙酮酸脱氢酶复合体的β亚基蛋白(Pyruvate dehydrogenase complex subunit E1β, PDHE1β, 丙酮酸脱氢酶是柠檬酸循环的限速酶)表达量在极端低氧情况下比平原蝗虫要高，深入研究发现其编码基因启动子区域发生了变异，这一变异使PDHE1β在高原蝗虫中不会因低氧而导致表达量下降，从而使其能够更好地利用有氧代谢在极端低氧时产生ATP(Zhaoetal., 2013)。还有研究表明，低氧处理对西藏蝗虫和平原蝗虫的氧化磷酸化反应均有显著抑制作用，但对西藏蝗虫的抑制作用较小。因为西藏蝗虫的细胞色素C氧化酶(cytochrome C oxidase, COX)在常氧和低氧件下均表现出较高的活性，这使得西藏飞蝗的线粒体能够在低氧环境中更有效的利用氧气(Zhangetal., 2013)。这就说明低氧环境中，昆虫也可以通过提高氧气的利用效率来增强自身在低氧环境中的存活。

综上，代谢适应对于昆虫在低氧环境中生存是一项重要条件，无论是提高氧气利用率还是降低氧气的需求量都是为了保持昆虫在低氧环境中的代谢稳态与能量供给，但为了达到这一目的，昆虫的适应方式应该不仅仅局限于此。因此，从多角度探寻昆虫低氧适应中维持代谢稳态可能是一个重要方向。

6 低氧适应的关键分子通路

昆虫中与低氧相关的代谢通路主要包括胰岛素(Insulin/Insulin-like)信号通路和低氧诱导因子(HIF)信号通路，这两条通路从多方面调节昆虫在低氧环境中的适应生存，包括生长发育、能量代谢、气管系统可塑性等(图1)，但这两条通路在调节低氧响应上具有不同的特征，我们在下面分开说明。

图1 昆虫低氧适应相关信号通路和功能Fig.1 Hypoxic adaptation related signaling pathways in insects注：由缺氧直接引起的通路反应(黑色实线)和由缺氧间接引起的通路反应(黑色虚线)；通路间的相互作用(红线)；通路引起的功能反应(蓝线)。Note:Pathway response directly (black solid line) and indirectly (black dotted line) induced by hypoxia; Interaction between pathways (red line); functional response regulated by signal pathway (blue line).

6.1 胰岛素(insulin/insulin-like)信号通路

胰岛素信号通路是生物体内重要的调控能量代谢的途径，胰岛素信号通路活性增加可导致能量代谢增强，但在低氧环境中旺盛的能量代谢可能会导致细胞氧化压力的增加进而对机体产生有害的作用。对线虫的研究表明，秀丽线虫Caenorhabditiselegans中胰岛素/胰岛素类似物生长因子(insulin/insulin-like growth factor, IGF)受体同源基因daf-2突变体在低氧环境中的寿命比野生型明显延长，而将daf-2重新在神经系统或肌肉中回补后，线虫在低氧环境中的死亡率重新提升，这一结果证实了上述结论(Scottetal., 2002)。不同的是，在果蝇中发现，低氧处理会降低果蝇组织中胰岛素通路的活性，同时增加其大脑内胰岛素生成细胞中胰岛素样多肽2的含量；除此之外，在缺氧条件下，在果蝇幼虫全身或者气管组织中过表达胰岛素受体，增强了气管的可塑性，增强了缺氧期间的氧气输送(Harrison and Haddad, 2011; Wongetal., 2014)。以上说明胰岛素信号通路可以调节低氧下昆虫的发育过程。最新的研究揭示自然选择如何作用于昆虫胰岛素通路关键基因，来调节昆虫对低氧的适应性(图2)。PTP1B是一种酪氨酸磷酸酶，通过对胰岛素受体的酪氨酸位点去磷酸化从而达到抑制其功能，进而抑制整个胰岛素信号通路。果蝇PTP1B同源蛋白，在低氧下可降低胰岛素受体的活性(Leeetal., 2008)。基于飞蝗西藏种群和平原种群的比较基因组学发现，编码PTP1B的基因PTPN1在西藏飞蝗中受到很强的自然选择作用。PTPN1基因具有一个氨基酸变异位点，导致其编码蛋白脯氨酸富集构域(Pro-Rich)发生突变(p.Asn349Ile)，而且该变异位点的频次呈现海拔梯度变化。西藏飞蝗在低氧暴露下表现很强的代谢稳态，而功能研究发现，正是该突变钝化了胰岛素信号通路对低氧的响应，使西藏飞蝗在低氧环境下仍能维持适当水平的能力代谢水平和正常的活动(Dingetal., 2018)(图2)。该类研究使我们对昆虫在代谢上适应长期低氧环境的机制有了新的认识。

图2 去磷酸化酶PTP1B蛋白突变对胰岛素信号通路的影响Fig.2 Effects of PTP1B protein mutation on insulin signaling pathway注：在平原飞蝗体内，在低氧环境中野生型PTP1B酶活性升高，使胰岛素受体对胰岛素的敏感性降低，减弱了能量代谢过程；在西藏飞蝗体内，突变型PTP1B对低氧敏感度降低，胰岛素通路活性维持稳定，从而可以在低氧环境中保持稳定的能量的代谢水平。Note:Under hypoxic environment, the lowland locusts possessing wild-type PTP1B increase the enzymatic activity of PTP1B that in turn, reduces the sensitivity of the insulin receptor to insulin and represses the energy metabolism. As a contrast, the Tibetan locusts harboring the mutant PTP1B possess a reduced sensitivity to hypoxia, and stable insulin pathway activity, thereby maintaining a stable energy metabolism level in a hypoxic environment.

6.2 低氧诱导因子(HIF)信号通路

HIF通路在低氧环境中维持细胞稳态和存活起到了至关重要的作用，并且其在气管系统可塑性和调控昆虫生长和发育扮演了重要的角色。最先发现HIF作为转录因子，当被激活后，HIF会结合在位于其靶标基因启动子区的低氧响应原件(Hypoxic response element, HRE)上，并调控基因的转录(Semenza, 2003)。HIF由两个亚基组成，α亚基和β亚基。β亚基稳定表达在细胞核中，而α亚基则受到氧气的抑制，当氧气含量降低，抑制才会被解除。人类的HIF通路在低氧环境下参与一系列细胞过程的调控，包括调节细胞代谢，促进无氧呼吸而抑制有氧呼吸(Kimetal., 2006)，在低氧环境中优化线粒体功能(Fukudaetal., 2007)，促进血管生成和红细胞的生成，诱导炎症反应以及调节细胞的增殖和凋亡等(Dengleretal., 2014)。在短期且急性的低氧刺激下可以激活HIF-1α，而较长时间的低氧刺激下则会激活HIF-2α转录活性(Kohetal., 2011)。在对西藏人低氧适应遗传机制研究中发现了HIF-2α(EPAS1)的变异，该变异与西藏人在高原地区患慢性高山症的概率较低有关(Pengetal., 2017)。而HIF-3α则参与抑制HIF-1/2α的过程。同时HIF-3α也被发现在斑马鱼胚胎中参与调控胚胎发育过程(Zhangetal., 2014)。此外，在线虫的研究中发现HIF过表达可以增强机体对氧化压力的抵抗能力，从而延长线虫的寿命(Zhangetal., 2009)。

而在昆虫的研究中，HIF参与调节昆虫低氧适应鲜有相关报道。在果蝇中，HIF-α的同源蛋白被称为sima，其最早在果蝇胚胎中被发现(Lavista-Llanosetal., 2002)。气管的末端细胞可以通过“氧传感器”——Fatiga感知低氧，从而导致sima在这些细胞中不断积累，而sima的积累诱导了Btl(一种成纤维细胞生长因子受体)的表达，Btl的高表达提高了其与配体Bnl的结合水平，从而诱导了末端细胞的分支生长(Centaninetal., 2008)。sima与哺乳动物中HIFα亚基类似，受低氧处理的激活，在常氧环境中则被降解。HIF-1还负责急性反应，使多种参与细胞代谢、细胞死亡和细胞生长的基因恢复活性。黑腹果蝇的研究发现，HIF-1可以调控赖氨酸特异性去甲基化酶2(KDM2)家族成员，帮助协调细胞对缺氧的反应(Batieetal., 2017)。重要的是，sima基因在果蝇中也调控气管系统的分支和生长，与人类中HIF调控血管生成相似。由上分析可知，HIF信号通路在进化上非常保守，值得我们开展其低氧感知和适应方面功能的深入研究。

同时研究发现，HIF信号通路和Insulin信号通路相互作用。对埃及伊蚊A.aegypti的研究中发现，细菌所引起的肠道内缺氧是埃及伊蚊幼虫生长到临界大小，蜕皮激素(20-Hydroxyecdysone, 20E)释放和羽化所必需的信号(Coonetal., 2017)，而这一信号是通过HIF信号通路来实现的，即在埃及伊蚊幼虫体内，HIF信号通路可以激活AMP依赖的蛋白激酶信号(Adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase, AMPK)和胰岛素生长因子信号(insulin/insulin growth factor signaling, IIS)来调节埃及伊蚊幼虫的成长和代谢(Valzaniaetal., 2018)。

前述结果表明，HIF信号通路对于昆虫在低氧适应中的重要作用，不仅体现在其是昆虫应对低氧环境的有效途径，更体现在其作为诱导生长和发育的重要信号通路。由此可见，昆虫在漫长的低氧适应进化过程中，不仅发展出了一系列应对低氧环境的机制，还将低氧作为自身生长和发育的条件之一。因此，低氧适应与调控对于昆虫的进化和发展具有重要作用。

6.3 其他遗传机制

显然参与昆虫低氧适应的分子机制是多方面的。科研人员比较了栖息于青藏高原的草原毛虫和其低海拔近亲草原毛虫的转录组，受到自然选择的基因富集通路包括mTOR信号通路中的正选择基因，包括线粒体加工肽β亚基(Mitochondrial-processing peptidase subunit beta, MPPB)、mTOR调节相关蛋白(Regulatory associated protein of mTOR, RAPTOR)和胞内氯离子通道4(Chloride intracellular channel exc-4, EXC4)(Zhangetal., 2017)。而在对大山雀的研究中发现，mTOR通路对于其沿海拔低氧适应相关(Quetal., 2015)。这就表明mTOR通路在昆虫低氧适应中起到了关键作用并且可能与脊椎动物保守。对实验室培育出的极端耐低氧品系果蝇研究发现，Notch通路相关基因受低氧选择，抑制低氧耐受果蝇的Notch信号通路显著的降低了果蝇低氧下的存活率(Zhouetal., 2011)。在另一项研究中，科研人员比较了非洲东部栖息于不同海拔的同种蜜蜂的基因组，两个不同的蜜蜂种群在外形和行为上都有明显的差异，结果显示两个蜜蜂种群的遗传背景差异很小，然而两个种群在7号染色体上存在一个显著的分化，位于该分化位点的基因编码蛋白为多巴胺受体。这些蛋白的功能与蜜蜂的学习和采集行为密切相关，可能有助于提高其对高原环境的适应(Wallbergetal., 2017)。

在人类高原低氧适应研究中发现的许多基因功能在昆虫中也得到很好的验证。在一项慢性高原病的研究中，科研人员通过对患有慢性高原病的人群和非患病人群进行了全基因组水平的比较，并筛选得到一系列相关的遗传差异基因。随后科研人员在果蝇中得到这些差异基因的同源基因并在果蝇中进行了体内功能验证。该研究中鉴定了除了之前报道的慢性高原病相关基因SENP1以外，一些从未报道的基因如：SGK3,COPS5,PRDM1和IFT122也被发现。其中SENP1，SGK3和COPS5为HIF通路的关键基因，而PRDM1为非HIF通路依赖的低氧适应基因。在果蝇中对这些基因进行验证发现，果蝇的耐低氧能力显著增强(Stobdanetal., 2017)。使用同样的方式，科研人员通过研究埃塞俄比亚高原人种的受选择基因，并使用果蝇进行验证，最终筛选出了3个未曾报道的基因参与低氧适应过程，这些基因分别是：CIC,LIPE和Paf-Aha(Udpaetal., 2014)。在另一项研究中，科研人员通过筛选和验证了耐低氧果蝇中受选择基因，这些基因的同源基因同时也在高原人种包括西藏人、夏尔巴人、埃塞俄比亚人和安第斯人的自然选择基因中被发现(Jhaetal., 2015)。以上这些结果说明，对于昆虫低氧适应的研究可以为理解低氧相关的人类疾病机理提供一定的参考作用，同时昆虫具有良好的遗传可操作性，为研究遗传进化和功能验证提供的良好平台。

7 展望

昆虫作为世界上分布最为广泛的生物之一，对其低氧适应的研究无疑将会为近代医学的发展提供极大的便利。目前对于昆虫的低氧适应研究主要停留在遗传机制的研究之上，而存在于遗传机制背后更深层的分子机制依旧是存在不少的空白，例如，有研究证明PTP1B在低氧处理的平原飞蝗中出现了酶活性的上升，但是导致其活性提高的分子机制需要进一步研究；其次，在高原低氧环境中长期生存的昆虫能够保持活跃的能量代谢，而活跃的能量代谢会增加机体的氧化压力，昆虫如何抵御这种氧化压力的分子机制尚未明确；除此之外，对于长期生活在低氧环境中的昆虫，如何提高氧气运输、增加氧气利用率虽然有相关报道，但仅是针对遗传机制的的研究，其背后的分子机制也没有深入探讨。对于这些分子机制的进一步研究，必然是未来生物科学领域的一大挑战，突破这一挑战不但能更深层次的了解昆虫如此繁盛的原因，更能对一些重大疾病的发生、发展过程提供一些丰富的启示。

致谢:感谢张振宇博士和赵德健博士在文献收集及编写过程中给予的帮助。