口服替诺福韦对心型肌酸激酶检测的影响

王鹏程，张 冉，陈立华，徐 丹，罗向波，黄维亮

（1.湖南师范大学医学院，长沙 410013；2.长沙市第一医院检验科，长沙 410005）

艾滋病患者因为病毒血症控制不佳、抗病毒药物的副作用等原因［1，2］，比非艾滋病患者面临更高的心血管疾病风险。心型肌酸激酶（CK-MB）是肌酸激酶（CK）同工酶之一，具有良好的心肌组织特异性［3］，是艾滋病患者最常用的心肌损伤标志物。目前国内临床实验室多采用免疫抑制法定量检测CK-MB 活性。替诺福韦是高效联合抗逆转录病毒治疗的主流药物，属于核苷类逆转录酶抑制剂，主要用于艾滋病患者和乙型肝炎患者的抗病毒治疗。富马酸替诺福韦二吡呋酯（TDF）是替诺福韦的前体药之一。据报道［4，5］，TDF 治疗艾滋病导致患者体内广泛型线粒体CK（uMtCK）形成，对免疫抑制法检测的CK-MB 活性造成干扰，但国内尚未见相关报道。CK-MB 质量浓度检测是一种定量检测方法，不受溶血、巨CK 的干扰［6］。本文采用回顾性分析的方法，在采用免疫抑制法监测艾滋病患者心肌损伤的同时，利用剩余血清检测CK-MB 质量浓度，研究口服TDF 对心型肌酸激酶检测的影响，为临床实验室CK-MB 检测方法选择提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2019 年9 月～2019 年12 月在长沙市第一医院HIV 门诊就诊的患者，所有患者均符合《中国艾滋病诊疗指南（2018 版）》关于艾滋病的诊断标准，经高效联合抗逆转录病毒治疗6 个月以上。

1.2 方法

1.2.1 门诊病历资料收集 在医院信息系统中查询患者历次门诊病历资料，收集患者性别、年龄等基本信息，以及6 个月内的用药史、心血管疾病史等病历资料。

1.2.2 分组设计 根据患者HAART 方案中是否含有TDF 将其分为TDF 组和非TDF 组。分组标准：HAART方案中不含TDF 的患者，或曾经用过TDF 但己停用 3个月以上者，纳入非TDF 组；HAART 方案中含TDF，且服用TDF 1 月以上者纳入TDF 组。

1.2.3 疫抑制法检测CK-MB 活性 患者采血后，室温放置30 min，水平离心机3000 r/min 离心5 min 分离血清，使用雅培C16000 全自动生化分析仪检测血清CK-MB 活性，检测方法为分光光度计比色法，检测原理为免疫抑制法，即利用针对M 亚基的特异性抗体屏蔽样本中M 亚基的活性，测得的B 亚基活性乘以2。CK-MB 活性实验室参考范围为0～24 U/L。检测试剂及质控品由宁波美康生物生产，校准品由朗道生物生产。检测完成后将血清冻存于-80℃冰箱内，用于CK-MB质量浓度测定。

1.2.4 CK-MB 质量浓度测定 室温解冻冻存血清，使用深圳华迈兴微医疗科技有限公司生产的MF05 半自动化学发光免疫分析仪检测CK-MB 质量浓度，检测方法为微流控磁微粒化学发光法，该方法将双抗体夹心法与化学发光法相结合，采用微流控芯片，以磁微粒为固相载体，加入样本后，形成“磁微粒标记抗体-CKMB 抗原-AP 标记抗体”的三明治结构复合物，通过检测该复合物在发光基底液中的发光强度值，计算样本中CK-MB 质量浓度。CK-MB 质量浓度实验室参考范围为0-5μg/L。检测试剂、质控品、校准品均由华迈兴微医疗科技有限公司生产。

1.3 统计学处理 使用GraphPad Prism8 软件分析数据。计量资料结果用均数±标准差表示，两组间的差异比较使用t 检验，计数资料结果用率（%）表示，两组间的差异比较使用卡方检验，两因素间的相关性分析使用线性相关法。以P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 选取的170 例HIV 门诊患者治疗规律，病情稳定，近6 个月内无心肌损伤的病史记录。其中，有8 例患者应用TDF 治疗不足1 个月，未进入统计。纳入TDF 组114 例，纳入非TDF 组48 例。两组性别、年龄比较无统计学差异（P>0.05），见表1。

2.2 两组间CK-MB 活性及CK-MB 质量浓度比较 TDF 组CK-MB 活性为45.99±21.08 U/L，非TDF 组CK-MB 活性为14.21±3.27 U/L，两组间比较差异有显著性（P<0.0001），TDF 组CK-MB 质量浓度为1.61±1.13μg/L，非TDF 组CK-MB 质量浓度为1.86±0.93μg/L，两组之间比较差异无显著性（P>0.05），见表2。

表1 两组人口学资料比较

表2 两组间CK-MB活性及CK-MB质量比较

2.3 CK-MB 活性与CK-MB 质量相关性分析 非TDF 组CK-MB 活性与CK-MB 质量浓度之间具有高相关性（r =0.963），TDF 组CK-MB 活性与CK-MB 质量浓度之间无相关性（r =0.094），见图1。

图1 两组CK-MB活性与CK-MB质量相关关系

3 讨论

CK-MB 可用于诊断急性冠脉综合征和病毒性心肌炎，临床应用广泛。CK-MB 有多种测定方法。琼脂糖凝胶电泳能够很好地区分CK 同工酶，曾长期作为CKMB 测定的参考方法，但其敏感性低，对低浓度的CKMB 定量不准确，而且操作烦琐，耗时长，不利于临床诊断；免疫抑制法大大提高了CK-MB 测定的敏感性，操作简单，检测迅速，但容易受溶血和巨CK 的干扰；CKMB 质量浓度测定常采用化学发光法，不受溶血和巨CK 的影响，能准确定量，但成本高。本研究中，TDF 组CK-MB 活性明显高于非TDF 组，但两组间CK-MB 质量浓度差异不大，且TDF 组CK-MB 活性与CK-MB 质量浓度无相关性，间接证实了uMtCK 对CK-MB 活性检测的干扰作用。因此，在临床工作中，治疗规律、病情相对稳定的艾滋病患者和乙型肝炎患者出现CK-MB活性显著升高，应当先明确治疗方案中是否含有替诺福韦前体药或复方制剂，以避免不必要的检查，加重患者经济和心理负担。

替诺福韦治疗后，uMtCK 导致血清CK-MB 活性假性升高，属于系统误差，应当进行纠正。除外成本因素，用CK-MB 质量浓度测定代替常规心肌酶谱中的CKMB 活性检测是一个不错的选择。同时，线粒体CK 和胞质CK 具有不同的蛋白质一级结构，表面静电电位和疏水性存在差异，因此可以开发出针对线粒体CK 的特异性抗体，对目前临床实验室使用的CK-MB 活性检测试剂盒进行改良。Hoshino 等［7］在CK-MB 试剂盒中，同时添加针对M 亚基的抑制性抗体和针对线粒体CK的抑制性抗体，替代单一针对M 亚基抑制性抗体，取得了良好的效果，但该方法的临床应用有待进一步验证。 本研究只证明了uMtCK 对CK-MB 检测的干扰作用，没有定量测定患者的uMtCK。uMtCK 位于线粒体嵴和线粒体内外膜之间，分子量大，为2 型巨CK，在外周血中含量极低［8，9］。据报道［10，11］，uMtCK 升高主要见于肿瘤患者，可能与肿瘤细胞的增殖和凋亡有关。Uranbileg 等的研究［12］发现肝细胞癌患者肿瘤组织中uMtCK mRNA 和蛋白表达增加，但在该患者的非肿瘤肝组织中表达正常。替诺福韦治疗导致uMtCK 升高的机制尚不明确，Maria Saumoya 等［13］在研究一例经替诺福韦治疗后发生肾损伤的HIV 感染者时发现，该患者外周血单个核细胞、口腔黏膜细胞、毛囊细胞线粒体DNA 含量降低，停药后线粒体DNA 含量逐步回升，Milian 等的研究［14］发现替诺福韦在细胞内累积引发线粒体毒性，影响细胞增殖和细胞活力，这引起研究表明艾滋病患者化疗后血清uMtCK 升高的机制可能与肿瘤患者不同。Schmid 等的研究［15］认为艾滋病患者化疗后血清uMtCK 升高可能与轻微的线粒体损伤、uMtCK 代偿性表达增加、替诺福韦对uMtCK 空间结构的稳定作用有关。总之，口服替诺福韦会导致外周血uMtCK 升高，干扰免疫抑制法检测CK-MB 活性，导致假性升高，但uMtCK 升高的具体机制有待进一步研究。