白杨素及其类似物BrMC 对SMMC-7721 细胞系球细胞DNMT1 活性和球形成的影响

李 程，陈 阿，许 畅，邱叶贝，曹建国，杨剑锋

（湖南师范大学医学院基础医学系，长沙 410013）

先前的研究已经证实饮食黄酮白杨素（（5，7-二羟基黄酮，Chrysin，ChR）及其类似物8-溴-7-甲氧基白杨素（8-bromo-7-methoxy chrysin，BrMC）具有抑制肝癌干细胞样细胞功能和特性作用［1，2］，然而，其作用分子机制尚未完全阐明。新近的研究表明，DNA 甲基化是多种类型人实体瘤，包括肝细胞癌的关键表观遗传学调控机制［3，4］。有研究发现儿茶素、金雀异黄素、醉茄素A、姜黄素和白藜芦醇等天然化合物抑制乳腺癌细胞系细胞DNMT1 表达［5］。但是，BrMC 是否抑制DNMT1活性靶向抑制肝癌干细胞样细胞功能和特性，鲜见报道。本文的主要目的是确定ChR 及其类似物BrMC 是否对人肝细胞癌SMMC-7721 细胞系球细胞的DNMT1活性和自我更新能力有抑制作用。

1 材料与方法

1.1 球细胞的培养和药物处理 按照先前发表文献［6］描述的方法得到人肝细胞癌SMMC-7721 细胞（中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库）系球细胞；测定肝癌球形成率（%）；在第1 次球形成培养中分别加入ChR（美国Sigma 公司，终浓度：40μM）或BrMC（参照文献［7］合成与结果确证，终浓度：5 和10μM）孵育6d。而在第2 次球形成培养中测定肝癌球形成率。

1.2 DNMT1 活性测定 依据先前发表文献［8］的方法

提取核蛋白、测定核蛋白DNMT1 浓度，然后，依据工作标准曲线：y=0.3005x + 0.1967（R²=0.9923）计算出各样本中DNMT1 的浓度。然后，以溶媒处理肝癌球细胞的DNMT1 浓度为1.0 计算ChR（40μM）或BrMC（5 和10μM）处理72h 的相对DNMT 活性。

1.3 qRT-PCR 按照先前发表文献［6，8］的方法和步骤用qRT-PCR 测定CD133 和CD44 mRNA 表达水平。CD133 扩增引物（正向：5′-CAGATGCTCCTAAGGCT TG-3′；反向：5′-GCAAAGCATTTCCTCAGG-3′）、CD44 引物（正向5′-CCGCTATGTCCAGAAAGGA-3′；反向：5′-CTGTCTGTGCTGTCGGTGAT-3′）和β-actin 引物（）正向：5′-ACAAAACCTAACTTGCGCA G-3′；反向：5′-TCCTGTAACAACGCATCTCA-3′由上海生工公司（中国上海市）合成。用β-actin mRNA 标化CD133 和CD44 mRNA 相对表达水平。2-ΔΔCt方法计算mRNA 相对表达水平。

1.4 统计学分析 SPSS 20.0 for windows evaluation 软件（SPSS Inc，Chicago，IL）用于本文研究的数据分析。与溶媒（0.1% DMSO）对照组均数比较采用Student’s t检验。所有配对组均数的比较应用单向方差分析（One Way ANOVA）的Tukey's 检验，P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ChR 和BrMC 抑制SMMC-7721 细胞系球细胞的肝癌球形成能力 在第1 次球形成培养中，ChR（40μM）和BrMC（5 和10μM）持续作用6d，SMMC-7721细胞系球细胞第2 次球形成培养的肝癌球形成率显著降低（图1，P<0.05）。

图1 ChR和BrMC对SMMC-7721细胞系球细胞的肝癌球形成能力的影响

2.2 ChR 和BrMC 抑制SMMC-7721 细胞系球细胞DNMT1 活性 ChR（40μM）和BrMC（5 和10μM）处理72h 能有效地降低SMMC-7721 细胞系球细胞DNMT1活性（图2，P<0.05）。

图2 ChR和BrMC对SMMC-7721细胞系球细胞DNMT1活性的影响ELISA测定ChR（40μM）和BrMC（5和10μM）处理72h的球细胞DNMT1活性（mean±SD，n=3）。与0.1%DMSO处理组比较：*P<0.05；与ChR（40μM）处理组比较：# P<0.05。

2.3 ChR 和BrMC 下调SMMC-7721 细胞系球细胞CD133 mRNA 表达 ChR（40μM）和BrMC（5 和10μM）处理24h 显著降低SMMC-7721 细胞系球细胞CD133 mRNA 表达水平（图3，P<0.05）。

图3 ChR和BrMC对SMMC-7721细胞系球细胞CD133 mRNA表达的影响 qRT-PCR分析ChR（40μM）和BrMC（5和10μM）处理24h的球细胞CD133 mRNA表达水平（mean±SD，n=3）。与0.1%DMSO处理组比较：* P<0.05；与ChR（40μM）处理组比较：# P<0.05。

2.4 ChR 和BrMC 下调SMMC-7721 细胞系球细胞CD44 mRNA 表达 ChR（40μM）和BrMC（5 和10μM）处理24h 显著降低SMMC-7721 细胞系球细胞CD44 mRNA 表达水平（图3，P<0.05）。

图4 ChR和BrMC对SMMC-7721细胞系球细胞CD44 mRNA表达的影响 qRT-PCR分析ChR（40μM）和BrMC（5和10μM）处理24h的球细胞CD44 mRNA表达水平（mean±SD，n=3）。与0.1%DMSO处理组比较：*P<0.05；与ChR（40μM）处理组比较：#P<0.05。

3 讨论

我们先前的研究显示建立肝细胞癌细胞系球细胞能有效富集肝癌干细胞，可作为肝癌干细胞样细胞实验系统［9，10］。与先前的研究结果一致，本文的结果再一次证明饮食黄酮ChR 及其合成类似物BrMC 显著降低SMMC-7721 细胞系球细胞的二次球形成能力。这些结果建议ChR 和BrMC 能在体外培养细胞系统中减少或消除肝癌干细胞样细胞。

DNMT1 是一种主要的、广泛表达的基因DNA 甲基转移酶。DNMT1 优先选择DNA 复制过程中形成的以半甲基化状态存在的DNA 双链作为催化底物。已有研究证实，DNMT1 是维持造血干细胞、间质干细胞、白血病干细胞和乳腺癌干细胞特性的关键因子［11］。我们曽经报道DNA 甲基转移酶抑制剂地西他滨通过抑制DNMT1 表达减弱SMMC-7721 源性LCSLC 自我更新能力［6］。尽管人们已经发现ChR 是一种DNA 甲基转移酶和组蛋白甲基转移酶的双重抑制剂［12］，本文的实验研究首次发现ChR 的人工合成类似物BrMC 能有效地抑制SMMC-7721 细胞系球细胞DNMT1 活性，并且，作用效价强度高于先导化合物ChR。结合前述的BrMC 显著降低SMMC-7721 细胞系球细胞的二次球形成能力和下调肿瘤干细胞标志物CD133 和CD44 mRNA 表达的结果，我们有理由推断BrMC 可能通过抑制DNMT1活性从而减弱或消除SMMC-7721 细胞系球细胞的干性。

总之，本文的研究结果提示抑制DNMT1 活性可能是BrMC 体外减少或消除肝癌干细胞样细胞的作用机制之一。我们的研究结果为开发和研制以表观遗传调控为靶标有效防治人肝细胞癌辅助治疗剂提供实验和理论依据。