透明质酸基普鲁兰糖载药微球制备与体内外评价

杨文智，赵亚非，吴桐，刘娇艳，李海鹰

(河北大学 药学院，河北 保定 071002)

微球制剂作为缓控释给药新剂型之一，具有缓释药物、提高药物稳定性、保证疗效、减少给药频次和降低毒副反应等优点，受到药物研究者的青睐[1-2]，常见的载药微球可选择天然高分子、合成与半合成的高分子为载体，如：明胶、壳聚糖、淀粉、白蛋白、葡聚糖、海藻酸和透明质酸(HA)等天然高分子；聚乳酸、丙交酯乙交酯共聚物、聚3-羟基丁酸等聚酯类、聚丙烯酸树脂、聚酰胺、聚乙烯醇、乙基纤维素、纤维醋法酯等合成与半合成高分子材料. 普鲁兰多糖(Pu)由α-1,6糖苷键连接的麦芽三糖单元组成，出芽短梗霉分泌，可被淀粉酶降解，具有水溶性、无毒、无致突变作用、无免疫原性、无致畸作用、良好生物相溶性及可生物降解等优良特性，常用作药物载体的材料[3-6]. 为了拓展Pu在医药领域的应用，化学修饰Pu成为研究热点[7-8]. HA同样具有良好的生物相溶性、文献报道HA微球可靶向富含CD44受体的肠癌、乳腺癌和非小细胞肺癌等肿瘤细胞，故被广泛用于缓控释药物的载体[9-11]. 如：与游离阿霉素(DOX)相比，负载DOX的透明质酸-聚γ-苄基-L-谷氨酸胃蛋白体可靶向MCF-7肿瘤细胞，对乳腺癌有更好抑制作用[12]；采用HA包载拉帕替尼纳米晶，可抑制肿瘤生长，提高动物存活率[13]. 但单独使用HA作为药物微球载体，需克服其体内迅速降解的缺点[14-16]. 本课题组将HA接枝到Pu糖长链上，制备透明质酸接枝普鲁兰糖(HA-Pu)材料，该新型材料具有较好的生物安全性和抗酶降解性能，可减缓其在体内降解速度[17].本文拟采用抗酶降解的HA-Pu为微球载体材料，经化学交联制备负载抗肿瘤药物阿霉素的HA-Pu微球(DOX-HA-Pu MPs)，希望获得具备体内缓释抗瘤的载药微球制剂.

1 实验部分

1.1 仪器、试药与实验动物

LGJ-18冷冻干燥机(宁波新芝仪器有限公司)；DVM 6光学显微镜(德国徕卡公司)；FTIR-8400s傅里叶变换红外分光光度计(日本岛津仪器公司)；T6型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；LC 3000型高效液相色谱仪(北京创新通恒科技有限公司).

透明质酸(5400 Da，山东福瑞达医药公司)；普鲁兰糖(2000 KDa，日本林原化学株式会社)；阿霉素(大连美仑生物技术有限公司提供)；透明质酸接枝普鲁兰糖(HA-Pu)材料源于实验室自制[17]；其余试剂均是分析纯.

雄性Wistar大鼠(150～200 g)，由河北省实验动物中心提供(合格证号：1507012).

1.2 实验方法

1.2.1 HA-Pu微球或载药微球(DOX-HA-Pu MPs)的制备、优化及表征

称取HA-Pu适量，加入蒸馏水搅拌溶解，如：制备载药微球，将DOX加入HA-Pu获得药物与载体材料的水溶液. 将液体石蜡及适量Span 80充分搅拌混匀后，在其中缓慢滴入HA-Pu或载药载体材料水溶液，调节转速，乳化30 min，滴加适量戊二醛液，室温反应1 h，加入异丙醇，搅拌10 min，静置，过滤，乙醚洗涤，干燥，即得HA-Pu MPs或DOX-HA-Pu MPs.

采用BBD实验设计方法优化HA-Pu MPs处方，考察影响微球平均粒径的转速(X1，r/min)、油水比(X2,体积比)和HA-Pu溶液质量浓度(X3mg/mL)3个因素，采用丹东百特 BT-9300ST仪器，测定微球粒径，以微球的平均粒径(Y)为评价指标，建立数学模型，制备17批微球，优化微球处方. 3因素3水平的BBD实验设计见表1.

表1 BBD实验因素水平表(n=3)

取冻干后样品于无水乙醇中分散，将微球置于载玻片上，用显微镜观察其微观形态并拍照记录. 样品在红外灯照射下烘干，以干燥的KBr压片，分别测定HA、Pu、HA-Pu、HA与Pu的物理混合物、HA-Pu微球的红外光谱图，扫描波数4 000～400 cm-1，分辨率1 cm-1.

1.2.2 载药微球体外释放

配制盐酸阿霉素标准品液和HA-Pu液，在190～500 nm处紫外扫描，药物紫外最大吸收波长为254 nm，HA-Pu水溶液无干扰. 精密移取200 μg/mL盐酸阿霉素标准液，配制4、6、8、10、12、14和16 μg/mL阿霉素溶液，于254 nm处测定吸光度，以吸收值对质量浓度进行线性回归，获得阿霉素水溶液的标准曲线，考察阿霉素溶液样品日内和日间稳定性.

依照BBD筛选最佳处方，滴加0.5 mol戊二醛，评价药载比(DOX∶HA-Pu，质量比)为1∶10、2∶10、2.5∶10、3∶10、4∶10的载药微球载药量与包封率，获得最佳药载比，制备载药微球，备用. 在透析袋中放入1 mg/mL微球2 mL 混悬液，透析袋置于30 mL pH分别为1.2、6.8和7.4释放液中，在(37±1 )℃，100 r/min恒温振荡，定时吸取透析外液8 mL，同时补充等温等量缓冲液，254 nm处测定紫外吸收度，计算药物质量浓度和药物累计释放量.

取2 mg DOX-HA-Pu载药微球置于5 mL蒸馏水中，超声，4 000 r/min离心10 min，取上清液于254 nm处测定吸光度，依公式(1)和(2)分别计算微球的载药量(DD)与包封率(EE).

(1)

(2)

式(1)、(2)中，M为制得DOX-HA-Pu微球的总质量；M0为受试DOX-HA-Pu微球的质量；M1为受试DOX-HA-Pu微球中DOX的测定值；M2为制备DOX-HA-Pu微球时DOX的投药总量.

1.2.3 药物在大鼠体内药代动力学的测定

用肝素处理过的EP管收集大鼠眼眶血，5 000 r/min的条件下离心10 min，取血浆，备用. 配制0.2 mg/mL的阿霉素标准储备液，置于4 ℃冰箱，避光保存. 取阿霉素储备液，用甲醇配1、5、10、20和40 μg/mL对照品液，分别取10 μL，加入空白血浆190 μL，涡旋混合，加三氯甲烷-甲醇(体积比4∶1)0.5 mL，涡旋混合，在8 000 r/min的条件下离心10 min，取上清液，0.22 μm滤膜过滤，50 ℃氮气吹干，100 μL甲醇复溶，在10 000 r/min离心10 min，取20 μL进样，以峰面积(Y)对血浆药物质量浓度(X，μg/mL)进行线性回归，标准曲线方程为：Y=3 887.5X-1 114.8，R2=0.995(n=3)，在1～40 μg/mL内线性关系良好. 取健康雄性Wistar大鼠10只，随机分为2组，禁食12 h，自由饮水，分为腹腔注射10 mg/kg DOX-HA-Pu 微球混悬液组和尾静脉注射等量DOX药物溶液组，给药后0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24、36和48 h眼眶取血，离心，-20 ℃冻存，按照建立标准曲线的方法处理样品，采用HPLC法测定药物质量浓度，绘制药时曲线.

2 结果与讨论

2.1 HA-Pu微球制备

表2 制备微球平均粒径(n=3)

图1 搅拌速度(X1)、油水相比(X2)和 HA-Pu溶液浓度(X3)影响的等值线和曲面

2.2 HA-Pu微球的表征

冻干微球样品的光学显微镜图，见图2，微球球形圆整，表面光滑.红外图谱见图3，HA(3a)、Pu(3b)、HA与Pu物理混合物(3c)、HA-Pu(3d)和HA-Pu 微球(3e)中存在大量—OH与—CH2—基团，3 200～3 600 cm-1显示强的-OH伸缩振动峰，2 925 cm-1出现强的—H伸缩振动峰；HA、HA-Pu和HA-Pu微球中存在—NHCOCH3，故1 655 cm-1出现酰胺Ⅰ带吸收峰，而Pu不含酰胺基团，在1 655 cm-1处未见吸收峰，HA与Pu物理混合物此波数的酰胺吸收峰不明显；HA-Pu 微球相比HA-Pu 材料，在2 850 cm-1处出现游离醛基峰，1 733 cm-1处出现新羰基峰，而1 200～1 000 cm-1缩醛的C—O—C—O—C吸收峰增强，表明HA-Pu与戊二醛成功交联形成微球[21]，制备交联微球在光镜下显示出较好形态，见图2.

图2 透明质酸接枝普鲁兰糖微球光学显微镜图

a.透明质酸;b. 普鲁兰糖;c. 透明质酸普鲁兰糖混合物;d.透明质酸-普鲁兰糖;e.透明质酸-普鲁兰糖微球.

2.3 HA-Pu载药微球制备

盐酸阿霉素和HA-Pu水溶液的紫外扫描图显示，盐酸阿霉素最大吸收波长在254 nm，HA-Pu溶液不干扰阿霉素的紫外吸收，测定阿霉素溶液标准方程为y=0.0494x+0.0011(R2=0.999)，检测在4～16 μg/mL，阿霉素样品的日内和日间精密度RSD均小于2%. 采用BBD优化条件，制备DOX-HA-Pu MPs，分别采用0.167、0.334、0.5和0.667 mol戊二醛交联微球，考察微球载药量. 结果显示0.5 mol的戊二醛交联，微球获得5.02%最佳载药量. 表3考察不同药载比对HA-Pu MPs的载药量和包封率，DOX与HA-Pu投料比为2∶10(质量比)，DOX-HA-Pu MPs获得最佳载药量和包封率.

表3 DOX-HA-Pu MPs包封率(EE)和载药量( DD)

2.4 DOX-HA-Pu MPs体外释放

依最优条件制备DOX-HA-Pu MPs，其在不同pH释放介质的释药曲线见图4a.DOX-HA-Pu MPs 前4 h释药，在pH 6.8和7.4释放介质中分别达66%和64%，pH 1.2释药高达87%；24 h时pH 6.8和7.4释放介质释药均接近95%，显示出一定缓释行为. DOX-HA-Pu MPs最初4 h 内释放快，原因是吸附在微球表面和空隙内药物释放导致，而后微球内部的药物通过微球骨架缓慢扩散或HA-Pu材料降解释放，曲线趋于平缓. 将DOX-HA-Pu MPs的体外释药行为拟合,见图4b，拟合度和释放模型拟合结果见表4，由表4可知，DOX-HA-Pu MPs体外释药符合Ritger-Peppas方程，对于圆球形制剂，可根据Ritger-Peppas方程中t的指数n来推测药物从微球骨架结构中释放机制，计算n=0.20≤0.43，故药物的释放以Fick’s扩散方式为主.

图4 不同pH释放介质下DOX-HA-Pu MPs体外释药曲线(a)；pH 7.4释放液的释放模型拟合曲线(b)

表4 DOX-HA-Pu MPs不同模型的释药相关系数(R2)

2.5 载药微球体内药代

测得HPLC条件下盐酸阿霉素大鼠体内的标准曲线方程：A=3 887.514x-1 114.813，R2=0.995(n=5)，在1～40 μg/mL内线性关系良好. 4 ℃放置5 d，样品日内日间精密度均符合要求. 图5为Wistar大鼠尾静脉注射DOX·HCl生理盐水溶液和腹腔注射DOX-HA-Pu MPs微球液后的药-时曲线，游离药物注射达峰后迅速下降，24 h难检测，半衰期短(t1/2，4.55 h)，代谢较快，与文献报道的3.78 h一致[22]. 而腹腔注射DOX-HA-Pu MPs，t1/2延长至28.64 h，是游离药物的6.3倍；体内平均滞留时间(MRT)为16.77 h，是游离药物的3.5倍，载药微球组药物清除率低. 采用DAS 2.0软件处理药代参数，主要结果见表5.

图5 DOX·HCl和DOX-HA-Pu MPs的Wistar大鼠体内药-时曲线 (n=5)

表5 DOX·HCl和DOX-HA-Pu MPs在大鼠体内药代动力学参数(n=5)

T代表受试载药微球制剂，iv表示静脉注射DOX，D表示给药剂量，得到载药微球制剂的腹腔注射的绝对生物利用度为89.6%.

3 结论

采用乳化交联和BBD法，优化HA-Pu MPs制备处方，制备微球表面光滑，形态圆整且粒径均匀，红外谱图显示，成功获得交联微球. 以DOX·HCl为模型药物，制备载药量为5.02%的药物微球制剂. 载药微球体外释放受介质pH影响，偏酸介质可加速微球释药，pH 7.4模拟体液释放环境下，载药微球释药符合Ritger-Peppas方程，其通过Fick's扩散机制释药. 对比大鼠尾静脉注射DOX·HCl与腹腔注射DOX-HA-Pu MPs的药代动力学参数，载药微球释放具备较好的缓释能力.