蒲棒浸提液机制下黑木耳发酵方法及相关检测

平琳琳，吴亚楠，寇博翔，王谦

(河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002)

黑木耳(Auriculariaauricula)又名黑菜、木蛾、木菌等，属于担子菌纲、木耳目、木耳科、木耳属[1]，主要分布在中国东北三省、河北、河南、湖北、四川、贵州等地[2].研究表明，黑木耳发酵物能显著降低SD大鼠血清中的总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇[3]；其子实体多糖可以促进吞噬细胞的吞噬作用，从而提高机体免疫力.黑木耳不仅口味鲜美而且营养丰富，是中国传统的药食两用真菌[4-6].

蒲棒，又名蒲包草，是香蒲的果穗，其茸毛可药用，具有消炎止血功效.其上方部位的雄蕊花粉，又名蒲黄.研究表明，低剂量蒲黄煎剂和醇提取物可以使得兔和豚鼠心率减慢和血压降低[7-9]；家兔口服蒲黄，可以有效抑制其食饵性高胆固醇的形成；其水煎剂可调节免疫功能，浓缩外敷亦有杀菌消炎作用，极具药用价值.

随着社会发展，人们的保健意识逐渐提高，而食用菌极具保健开发价值.因此，利用蒲棒制成蒲棒水煎剂，对食药兼用的黑木耳进行发酵培养，并观察其发酵醪液对果蝇寿命的影响，为黑木耳新型功能食品的开发提供了新思路.

1 材料与方法

1. 1 材料

1.1.1 供试菌株和果蝇

供试菌株：黑木耳，由河北大学食药用真菌研究所提供.

供试果蝇：黑腹果蝇,由河北大学生命科学学院提供.

1.1.2 蒲棒提取液的制备

取狭叶香蒲蒲棒50 g，置于10倍蒸馏水中浸泡过夜，加热至沸后改用文火煎30 min，趁热过滤，滤渣再置于8倍水中，同法煎煮30 min，过滤，合并2次的滤液，放凉至室温备用[10].

1.1.3 培养基

斜面培养基(质量分数)：马铃薯 20%、葡萄糖 2%、磷酸二氢钾0.1 %、无水硫酸镁0.1%、琼脂2%，pH 自然.

液体菌种培养基(质量分数)：马铃薯20%、葡萄糖2%、磷酸二氢钾0.1%、无水硫酸镁0.1%，pH自然.

基础发酵培养基(质量分数)：蔗糖 3%、麸皮 4%、酵母膏 0.2%、磷酸二氢钾0.1%、无水硫酸镁0.1%，pH自然.

果蝇基础培养基(质量分数)：琼脂1.5%、蔗糖10%、玉米粉15%、丙酸1%.

1.1.4 主要试剂与设备

葡萄糖、磷酸二氢钾、 硫酸镁、蒸馏水、乙醚、乙醇、丙酸等；电子分析天平(FA2104)，压力蒸汽灭菌锅，超净工作台，恒温培养箱，恒温培养摇床等.

1.2 方法

1.2.1 黑木耳PDA斜面培养

将4 ℃保存的黑木耳试管菌种放置于室温或25 ℃的恒温培养箱中活化1～2 d，而后于超净工作台无菌环境下，使用接种钩转接黑木耳菌种至斜面培养基上，放入25 ℃培养箱恒温培养 8～10 d，待菌丝长满斜面培养基后进行下一步实验[11].

1.2.2 液体菌种制备

250 mL摇瓶装液量100 mL，接种黑木耳菌种，于25 ℃恒温培养箱静置24 h后，28 ℃、160 r/min振荡培养5 d，得到菌种作为一级菌种[12].

将一级菌种按照体积分数10%的接种量，接种至装有100 mL实验设计的不同发酵培养基的250 mL锥形瓶中，28 ℃、160 r/min振荡培养5 d[13].

1.2.3 液体培养基单因素实验

1) 蒲棒提取液发酵培养基碳源筛选实验

对蒲棒提取液发酵培养基中的碳源按表1进行筛选，选择最适碳源.

2)蒲棒提取液发酵培养基氮源筛选实验

对蒲棒提取液发酵培养基中的氮源按表2进行筛选，选择最适氮源.

表1 碳源的筛选Tab.1 Screening of carbon sources

表2 氮源的筛选Tab.2 Screening of nitrogen sources

1.2.4 正交实验

根据单因素实验结果选择最适的速效碳源葡萄糖、迟效碳源玉米粉和最适氮源豆饼粉、辅助氮源酵母膏作为正交实验的4个因素，每个因素设3个水平，设计 L9(34)正交实验因素水平表，详见表3.按照表3的安排进行实验，进行二级摇瓶培养，置于摇床28 ℃ 、160 r/min培养5 d.每个处理设置3个重复，在发酵结束后，测定鲜菌丝质量，分析统计结果，以确定最优培养基配方.

表3 液体发酵培养基正交实验因素水平

1.2.5 黑木耳液体发酵生长曲线的测定

将黑木耳一级菌种接入正交实验得出的最优配方发酵培养基中，进行二级发酵培养，以基础发酵配方为对照组，培养条件同上.自发酵开始计时，每过8 h取3瓶测定鲜菌丝质量，连续至7 d停止，记录数据并绘制生长曲线，确定最适菌龄.

1.2.6 果蝇寿命实验

利用筛选出的最优配方对黑木耳进行发酵培养5 d，将发酵醪液制成匀浆.挑选羽化后8 h内的果蝇，乙醚麻醉[14-15]后，将雌雄分开并分别分为5组，每组50只.5组分别包括1组空白对照组和4组实验组.

对照组培养基选用果蝇基础培养基，4组实验组培养基是于果蝇基础培养基内添加不同剂量的黑木耳发酵醪液匀浆.每组喂食10 g培养基，每5天更换1次培养基.记录5组的果蝇生存情况(每组的半数死亡时间、平均寿命)，并记录最后5只果蝇的寿命，求其平均值，得出果蝇最高寿命.此实验在秋季进行并完成.

2 结果与分析

2.1 液体培养基单因素实验结果

2.1.1 碳源筛选结果

不同碳源筛选实验结果见表4.由表4可以得出，黑木耳发酵于葡萄糖与玉米粉培养基下，鲜菌丝质量较高.在P=0.01下，葡萄糖与玉米粉对发酵培养无极显著差异，且菌球直径符合液体感官指标.因此，选择速效碳源葡萄糖与迟效碳源玉米粉作为最适复合碳源，进行后续正交实验.

表4 碳源筛选结果

*为100 mL发酵液过滤得到的鲜菌丝质量.

2.1.2 氮源筛选结果

不同氮源筛选实验结果见表5.由表5可以得出，在P=0.05 与P=0.01水平下，利用豆饼粉和酵母膏作为氮源培养黑木耳为宜，且菌球直径符合液体感官指标.因此，选择豆饼粉与酵母膏作为最适复合氮源，进行后续正交实验.

表5 氮源筛选结果

*为100 mL发酵液过滤得到的鲜菌丝质量.

2.2 正交实验结果

最优碳氮源正交实验结果见表6，液体培养基配方不同添加量下，所得的鲜菌丝质量具有差异.分析R值可知，因素A(葡萄糖)对黑木耳发酵培养影响最大，其次是因素B(玉米粉)，因素D(酵母膏)对黑木耳发酵培养效果影响最小.由表6可得，A2B2C3D1下鲜菌丝质量最大.在此配方基础上进行重组得到A2B1C2D1配方下所得的鲜菌丝质量更高，但组合不在正交表内.因此，选取组合方式为A2B1C2D1，即培养基中添加质量分数3%葡萄糖、3%玉米粉、2%豆饼粉、0.5%酵母膏时，黑木耳发酵效果最好.

表6 正交实验结果分析

*为100 mL发酵液过滤得到的鲜菌丝质量.

2.3 黑木耳液体发酵生长曲线的测定结果

黑木耳发酵生长曲线测定结果见图1.最优配方在120 h达到最高鲜菌丝质量(32.57 g)；较基础发酵培养基提前8 h，且最高鲜菌丝质量高出1.24 g.因此选择黑木耳在发酵时间为120 h时，制备黑木耳发酵醪液，用于后续果蝇寿命实验.

*为100 mL发酵液过滤得到的鲜菌丝质量.

2.4 果蝇寿命实验结果

2.4.1 雌性果蝇寿命实验结果

黑木耳发酵醪液匀浆对雌性果蝇的半数死亡期、平均寿命及最高寿命影响见表7.由表7可以看出，与对照组相比，当在培养基中添加发酵醪液匀浆时，对果蝇寿命均有不同延长.当添加体积分数30%的发酵醪液匀浆时，果蝇的半数死亡期延长最大，延长率达到17.04%；平均延寿率达到13.51%；最高延寿率达到14.76%.并且，均与对照组有显著性差异(P<0.05).

表7 雌性果蝇寿命实验结果

与对照组比较，*P<0.05，“-”表对照.

2.4.2 雄性果蝇寿命实验结果

黑木耳发酵醪液对雄性果蝇的半数死亡期、平均寿命及最高寿命影响见表8.由表8可以看出，与对照组相比，当在培养基中添加发酵醪液时，对果蝇寿命均有不同延长.当添加量增加至体积分数30%时，果蝇的半数死亡期延长最大，延长率达到18.39%；平均延寿率达到17.87%；最高延寿率达到17.91%.并且，均与对照组有显著性差异(P<0.05).

表8 雄性果蝇寿命实验

与对照组比较，*P<0.05，“-”表对照.

3 结论

通过研究，探索出了以蒲棒浸提液为基液下，黑木耳发酵的最优配方.利用黑木耳最优发酵配方，确定了其生长曲线和最佳菌龄.

初步研究表明，在普通培养基中，添加体积分数30%的黑木耳发酵醪液能够使果蝇寿命显著提高.本研究为黑木耳新型功能食品的开发提供了新思路.其中延长寿命的物质一般来说与大型真菌的多糖有关，但机理仍不能明确，有待进一步研究.