陈年白茶香气成分分析方法的优化及应用

宁芊，韦航，陈美卿，方灵，史梦竹，傅建炜*

1. 福建农林大学金山学院（福州 350002）；2. 福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所/福建省农产品质量安全重点实验室（福州 350002）

中国是茶的故乡，茶叶作为一种具有资源优势、保健功效、文化底蕴和消费传统的特色农产品，深受全球消费者的欢迎[1]。茶叶中的芳香物质是指茶叶中发挥物质的总称，茶叶中香气成分的含量虽然都很少，一般只占干物质的0.01%～0.05%，但其种类却非常复杂且对形成茶香起到重要作用[2]，是决定茶叶品质的决定性因素。据分析，通常茶叶含有的香气成分化合物达到300余种，鲜叶中香气成分的化合物有50种。

不同年份的茶叶，其主要成分会发生改变，其中香气成分也有所变化。一般当茶叶存放超过2年，茶的香气基本散失殆尽。但白茶却不同，白茶主产于福建，为中国特有的茶类。经过萎凋和干燥后，造就成茶外表满披白毫，汤色清淡且浅黄明亮，滋味鲜醇或清甜，且伴有毫香的独特品质特征。与其他茶叶相比，白茶存放时间越长，其药用价值越高，有“一年茶，三年药，七年宝”的说法[3-4]。随着贮藏年份增加，当年新白茶独有“毫香蜜韵”呈杏花香，存放3～8年后则呈荷叶香，8～15年转为枣香，15年以上则呈琥珀沉香。

采用现代仪器分析手段详细研究福建白茶的特征香气物质，识别出主要香气特征化合物，研究不同等级和不同年份的白茶香气物质的共同点和区别之处，对于丰富茶叶的香气分析技术，完善茶叶香气化学理论，对改善和提高茶叶的香气品质等均具有重要意义[5]。祁丹丹等[6]利用气相色谱-串联质谱结合化学计量学分析快速陈化和自然陈化白茶香气上的差异，刘琳燕等[7]、王力等[8]采用顶空固相微萃取后，经GC-MS鉴定不同年份白茶的香气成分，结果表明：顶空固相微萃取的结果在众多茶叶挥发性化合物测定中与感官审评的结果最为接近，但是它对萃取温度和萃取时间的依赖性很大。但目前对于白茶香气物质检测条件的优化研究，尚鲜见报道。

试验通过调整不同的检测条件，得到最优顶空固相微萃取-气相串联质谱（HS-SMPE-GC-MS/MS）检测方法，并应用于检测不同年份不同等级福建白茶的香气物质之间的区别，旨在提高白茶香气检测的精准度及陈年白茶香气组成研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

不同年份的白茶：2014年一级牡丹、2015年一级牡丹、2016年一级牡丹、2007年高级牡丹、2012年高级牡丹、2007年特级牡丹、2017年特级牡丹。

1.2 仪器与设备

岛津GCMS-TQ8040气相色谱-三重四级杆质谱仪；固相微萃取装置，SPME手动进样手柄（上海安谱科学仪器有限公司）和萃取头（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）；恒温水浴锅（朗越SYG-2，常州朗越仪器）；铁架台（扬州美家臣连教仪器厂）；40 mL透明顶空萃取瓶（Agilent RAISE）；40 mL样品瓶白色开口盖（RAISE）；含本色PTFE/本色硅胶垫；分析天平（AB204-5）。

1.3 试验方法

1.3.1 萃取头的老化

将固相萃取头在气相色谱进样口250 ℃老化20 min，除去可能残留在萃取头的吸附物。GC-MS进样检测，检测萃取头没有吸附茶叶香气的本底值，验证萃取头是否老化完全。

1.3.2 检测的条件优化

1.3.2.1 水浴吸附温度的优化

保持其他检测条件不变，在不同水浴吸附温度（30，50，70和90 ℃）下考察茶叶香气的物质检测情况，对比其出峰的数量和峰面积大小。

1.3.2.2 水浴吸附时间的优化

保持其他检测条件不变，在不同水浴吸附时间（15，30，45，60和90 min）下考察茶叶香气的物质检测情况，比较其出峰的数量和面积大小。

1.3.2.3 GC-MS升温程序的优化

保持其他检测条件不变，在不同气相升温程序下茶叶香气的物质检测情况，对比其色谱峰分离程度和峰面积大小。

1.3.2.4 GC-MS气相色谱条件进样优化

保持其他检测条件不变，在不同的进样方式下（不分流、分流）及不同分流比进样的条件下考察茶叶香气的物质检测情况，对比其色谱峰分离程度和峰面积大小。

1.3.3 茶叶香气萃取试验方法

试验前将固相微萃取头置于气相色谱仪进样口，经270 ℃老化15～20 min备用，称取3 g干茶样于40 mL顶空萃取瓶中，加盖密封。于恒温水浴锅中恒温水浴一定时间，使其达到气-液平衡。将老化好的萃取头插入样品瓶顶空部分，萃取一定时间，将萃取头取出，插入气质联用仪进样口，立即对所富集的香气进行3 min解析，然后运气GC-MS进行香气物质检测。

2 结果与分析

2.1 水浴萃取温度的优化

香气物质进入固定相的平衡时间与萃取的温度选择有关系，因此应选择适当的萃取温度条件，使其在合理的时间范围、GC-MS检测条件下能获得满意的灵敏。萃取温度分别为30，50，70和90 ℃时，香气成分的出峰情况如图1（a）～（d）所示。30 ℃时茶叶香气出峰的数量和峰面积比较小，随着萃取温度逐渐升高，茶叶香气的出峰数量明显增加，峰面积也有所变化，10～18 min的峰面积随着温度升高而逐渐减小，18～43 min的峰面积随着温度升高而逐渐增大，90 ℃条件下，10～25 min的峰有所减少，并且重复性差，不稳定，综合考虑选择70 ℃水浴进行检测。

图1 不同水浴吸附温度下茶叶香气成分色谱图

2.2 水浴萃取时间的优化

要使顶空、吸附薄膜和茶叶三相中物质均衡分配，并且保持在一定的平衡状态。分析物成分在三相中达到平衡所需要的时间即为在水浴中的萃取时间。萃取时间分别为15，30，45，60和90 min时的香气成分的出峰情况如图2所示。萃取吸附时间对茶叶香气成分的出峰情况有所影响，吸附时间越长，香气成分附着在萃取针就越多，但前面吸附的成分会脱附。经过比较在60和90 min时的出峰较多，响应值较好。萃取60 min，出峰数量达到最多，峰面积也达到最大，化合物的种类含量的萃取量达到最大值。随着水浴时间增加，大分子化合物出峰时间向后推移且萃取值相对减小，萃取时间对萃取量的影响有所不同。综合其色谱峰数量和峰面积大小，结果发现吸附萃取60 min的图谱最佳。故选择水浴萃取时间60 min。

图2 水浴温度下不同吸附时间茶叶香气成分色谱图

2.3 气相升温程序的优化

气相质谱检测条件是：DB-5MS气相毛细管柱（30 m，0.25 mm，0.25 μm），进样口温度250 ℃，进样时间1 min，分流进样，柱流速1 mL/min，质谱接口温度280 ℃，离子源温度200 ℃，质谱扫描范围m/z35～550。

通过改变不同的升温程序，确定条件为：起始柱温40 ℃保持2 min，3 ℃/min升温到170 ℃，以20 ℃/min升温到270 ℃，保持2 min。总共43.50 min，在此条件下能使色谱峰的分离度达到最佳。相应色谱图如图3所示。

2.4 气相色谱分流比的优化

分流比就是样品进到进样口后汽化产生的气体，进入色柱与排出进样的比例。因为样品汽化产生的气体不可能完全进入色谱柱，进行分离，再进入测器检测，一方面原因在于色谱柱的载样量不是无限大，过多的样品进入色谱柱会超载，造成分离效能下降，峰变形拖尾，还会影响到使用寿命；另一方面，色谱柱比较细，样品汽化产生气体膨胀后，不可能瞬间进入色谱柱，需要一定的时间，但又需要控制时间的长度，否则谱带会变宽。通过不同的分流比来选择合适的测试条件（分流比1︰1，1︰2和1︰5），出峰情况如图12～图14所示。分流比在1︰1和1︰2时的出峰情况比较好，综合考虑选择分流比1︰2的测试条件。

2.5 不同年份白茶（特级牡丹、高级牡丹、一级牡丹）香气成分分析比较

2.5.1 不同年份特级牡丹香气成分的差异

从图5的（a）和（b）可以看出特级牡丹香气化合物质总体的变化规律是随着储存时间延长，物质增加，大部分香气物质减少，部分香气物质增加，并且增加比较明显。

2017年特级牡丹的主要香气成分有116种，其中醛类16种、酯类9种、酮类18种，碳氢类46种、醇类15种、其他类12种；醇类化合物占色谱峰面积的34.8%。2007年特级牡丹中测得的主要香气成分有100余种。测得的特级牡丹的主要香气成分有芳樟醇、苯甲醛、苯乙醇、氧化芳樟醇、甜桦油、苯甲醇、β-紫罗酮、4, 6-二甲基十二烷、壬醛、十二烷、4-[2, 2, 6-三甲基-7-氧杂二环[4.1.0]庚-1-基]-3-丁烯-2-酮、1-十六烯、十四烷、二氢猕猴桃内酯、正己醛、咖啡因、2,6, 10-三甲基十三烷、2-己烯醛、反式-氧化芳樟醇、2-己基-1-癸醇、棕榈酸甲酯、N-乙基琥珀酰亚胺。

图4 不同分流比下茶叶香气成分色谱图

图5 不同年份特级牡丹香气色谱图

从所检测的数据中可得，2007年比2017年香气成分含量大部分减少，其中芳樟醇含量最大，减少量也最多，由23.53%降到5.89%，10年降低将近5倍，含量排名第二的苯甲醛也由原先的6.27%下降至1.47%，而2007年的β-紫罗酮则较2017年下降92.6%，为所有主要香气中下降最多的成分。但也有一部分香气成分含量增加，如苯乙醇、苯甲醇、壬醛、咖啡因、2, 6,10-三甲基十三烷、反式-氧化芳樟醇、2-己基-1-癸醇、棕榈酸甲酯、N-乙基琥珀酰亚胺等。其中，N-乙基琥珀酰亚胺、棕榈酸甲酯和咖啡碱，10后的含量分别为2007年的8.2，2.5及2.3倍。

2.5.2 不同年份高级牡丹香气成分的差异

对于高级牡丹来说，检测出的前20的香气成分含量大部分在随着储存时间增加而减少。2012年的高级牡丹，含量最高的是苯乙醇，占总体的6.33%，而在2007年中含量最高的是4, 6-二甲基十二烷（5.45%），醇类总量由2012年的22.41%下降为2007年的8.4%，而碳氢类总量则由2012年的6.86%上升至2007年的10.32%，这可能与白茶贮藏陈化过程发生的变化有关。也有一小部分含量在增加，如4, 6-二甲基十二烷、咖啡因、N-乙基琥珀酰亚胺、壬醛、3, 7-二甲基癸烷等。其中，具有月下香及紫罗兰香气的2-己基十二醇和具有温和的柏木香气的柏木脑分别为2012年的8.9倍和2.6倍。

图6（a）和（b）中高级牡丹香气化合物质总体的变化规律是随着储存时间延长，物质由大变小。高级牡丹的主要香气成分有苯甲醇、苯乙醇、氧化芳樟醇、苯甲醛、4, 6-二甲基十二烷、咖啡因、二氢猕猴桃内酯、N-乙基琥珀酰亚胺、反式-氧化芳樟醇、壬醛、顺-Α, Α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化呋喃-2-甲醇、3-甲基十一烷、棕榈酸甲酯、苯乙醛、3, 7-二甲基癸烷、二环己基甲酮、2-己基十二醇、5-(2-甲基丙基)壬烷、2, 4-二叔丁基苯酚、柏木脑。

图6 不同年份高级牡丹香气色谱图

2.5.3 不同年份一级牡丹香气成分的差异

不论是2016年还是2014年，一级牡丹香味成分中含量最高且种类最多，均为碳氢化合物，分别占总香气成分物质的19.51%和15.39%，这与之前特级牡丹和高级牡丹的检测结果稍有区别，也反映出不同等级批次的白茶在香气的组成比例上存在一定差异，这也是区别不同品级白茶的关键所在。虽然年份相隔不远，但经过2年存放，特级和高级牡丹中均存在的N-乙基琥珀酰亚胺和一级牡丹特有的带有土壤气味的3, 5-辛二烯-2-酮消失。但3-甲基十一烷、反式-氧化芳樟醇、苯甲醇、4, 6-二甲基十二烷等却有所增加。特别是苯甲醇，2014年较2016年增加4.4倍。

图7（a）和（b）的一级牡丹香气化合物质总体的变化规律是随着储存时间延长，物质由少变多又变少。2016年的一级牡丹香气物质比2014年的大得多。一级牡丹的主要香气成分有十二烷、咖啡因、苯甲醛、十四烷、芳樟醇、壬醛、苯乙醇、2, 6, 10-三甲基十五烷、2, 3a-二甲基六氢茚满-苯并呋喃、氧化芳樟醇、β-紫罗酮、2-溴十二烷、二氢猕猴桃内酯、3-甲基十一烷、N-乙基琥珀酰亚胺、反式-氧化芳樟醇、棕榈酸甲酯、苯甲醇、4, 6-二甲基十二烷、2, 4-二叔丁基苯酚、3, 5-辛二烯-2-酮、甜桦油、4-[2, 2,6-三甲基-7-氧杂二环[4.1.0]庚-1-基]-3-丁烯-2-酮。

图7 不同年份一级牡丹香气色谱图

3 讨论与结论

试验研究在不同萃取温度和萃取时间下顶空微萃取对白茶香味物质的富集效果，结果表明，在70 ℃萃取温度下持续萃取60 min，其萃取效果最佳；GC-MS最优分析条件为：手动进样，分流比1︰2；进样口温度250 ℃，GM-MS接口温度250 ℃；升温程序：起始柱温40 ℃保持2 min，以4 ℃/min升至170 ℃保持1 min，后再以20 ℃/min升至270 ℃，保持2 min。

白茶的储存时间对茶叶香气成分有很大的影响，含量会发生明显的变化。随着储存时间延长，茶叶香气中的成分含量会发生改变，有的香气成分会减少甚至消失，如醇类化合物均有不同程度的降低，其他香气成分如花果香型的芳樟醇及其氧化物[9-11]，有微弱苹果香气的苯甲醛，具有柔和玫瑰花香的苯乙醇[12]，有紫罗兰和木香香气的β-紫罗酮[13]，有麝香气息混合香豆素的二氢猕猴桃内酯[14]等白茶中的主要香气成分降低或是分解，使白茶清鲜、毫香感逐渐减少甚至消失。但有的香气成分含量会增加，如咖啡因，白茶中只有一级牡丹的咖啡因含量随着茶叶年份增加而降低，而特级牡丹和高级牡丹则是茶叶年份越久，咖啡因含量越高。此外，碳氢化合物，特别是烯类，也有不同程度增加，这可能是白茶贮藏陈化过程中的一个特点。所检测的烷烃类物质虽无芳香气味，但可能是通过与其他香气物质的互作效应从而间接促进香气的形成[15]。白茶中的主要香气成分与相关研究基本相同，但若干香气成分的结果有所偏差，可能是因为所采茶叶在制作的过程、储存条件、储存时间上的差异，或是试验操作过程中的一些偏差所致。