脂肪肝大鼠肝脏缺血损伤后透析液葡萄糖、乳酸、丙酮酸、甘油水平变化及意义

王进，王丹，郇传胜，李朝阳，吕伟，周丁华

(中国人民解放军火箭军特色医学中心，北京100088)

终末期肝病的最终治疗手段是原位肝移植，心脏死亡器官捐献(DCD)是主要的供肝来源，但DCD供肝常伴有严重的热缺血再灌注损伤，受者术后早期肝功能明显受到影响，移植物功能丧失发生率明显升高[1]。为了增加供肝来源，临床逐渐采用边缘性供肝，其中以脂肪肝最为常见。但脂肪肝比正常肝对缺血再灌注损伤更敏感，肝功能损害、肝细胞凋亡、微循环障碍及氧化损伤更明显，耐受缺血时间也比正常肝短，这些问题是脂肪肝供肝移植后患者肝功能障碍的主要原因[2,3]。因此，脂肪肝的脂肪变程度与移植后不良反应密切相关，决定了供肝能否用于移植手术。微透析技术是一种将灌流取样和透析技术结合起来，并逐渐完善的一种从生物活体内进行动态微量生化取样的新技术，具有活体连续取样、动态观察、定量分析、采样量小、组织损伤轻等特点[4]。通过微透析技术可观察肝脏细胞外液样本中化学物质改变，监测肝移植组织的代谢情况，提示细胞代谢异常或细胞受损状况[5]。2017年1～12月，本研究采用微透析技术对脂肪肝大鼠肝脏热缺血和冷缺血过程中的能量代谢指标进行监测，并探讨脂肪变和缺血损伤对肝脏代谢能力的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级SD大鼠12只，雄性，5～7周龄，体质量180～220 g。饲养于屏障设施内，室温控制在20～25 ℃，湿度40%～70%，12 h照明、12 h黑暗。微透析相关试剂复方氯化钠注射液、肝素钠注射液均购自上海第一生化药业有限公司，UW液购自美国Bridge to life公司。微透析设备CMA402双通道微量注射泵、CMA600微透析分析仪、CMA30线性探针以及微透析注射器、夹持器均购自瑞典CMA公司。

1.2 建模与分组处理 将12只SD大鼠随机分为C0组、C30组、F0组、F30组，每组3只。C0组、C30组喂饲标准饲料，F0组、F30组喂饲高脂饲料，连续喂养12周。各组术前禁食12 h，自由进水,称重后取仰卧位，戊巴比妥腹腔麻醉。C0组和F0组腹部正中线开腹，按体质量下腔静脉注入肝素100 U/100 g，结扎腹腔干以上主动脉；分别经主动脉和门静脉灌注UW液约20 mL，灌注后分离肝脏，置于冷保存液中进行冷缺血处理。C30组和F30组剪开膈肌，使心脏缓慢停搏5～10 min，造成无心跳供体(NHBD)的供肝模型，热缺血30 min后参照上法灌注UW液、分离肝脏并进行冷缺血处理。

1.3 肝脏透析液葡萄糖、乳酸、丙酮酸、甘油水平检测 采用微透析技术。各组冷灌注后将CMA30线性探针插入肝左叶，留在肝左叶内约1 cm。导管连接至微量泵，用无菌复方氯化钠溶液进行灌注，每20 min将透析液收集到微量管中。各组分别于冷缺血0、1、2、4、6、8、10、12 h，取透析液作为微透析标本，采用CMA600微透析分析仪用酶试剂和色谱方法自动检测葡萄糖、乳酸、丙酮酸、甘油水平，同时计算乳酸/丙酮酸。

2 结果

2.1 各组不同时间点透析液葡萄糖水平比较 与同组冷缺血0 h比较，各组其余时间点透析液葡萄糖水平均降低(P均<0.05)；随着冷缺血时间的延长，各组透析液葡萄糖水平均呈降低趋势。F0组冷缺血2～12 h透析液葡萄糖水平均高于C0组、F30组同时间点(P均<0.05)。见表1。

表1 各组不同时间点透析液葡萄糖水平比较

注：与同组冷缺血0 h比较，*P<0.05；与C0组同时间点比较，#P<0.05；与F30组同时间点比较，△P<0.05。

2.2 各组不同时间点透析液乳酸水平比较 与同组冷缺血0 h比较，C0组其余各时间点透析液乳酸水平均降低，C30组、F0组冷缺血4～12 h透析液乳酸水平均升高(P均<0.05)；随着冷缺血时间的延长，C0组透析液乳酸水平呈降低趋势，C30组、F0组呈升高趋势，F30组无明显变化。与C0组同时间点比较，其余各组透析液乳酸水平均升高，以F30组升高最明显(P均<0.05)。见表2。

表2 各组不同时间点透析液乳酸水平比较

注：与同组冷缺血0 h比较，*P<0.05；与C0组同时间点比较，#P<0.05；与F30组同时间点比较，△P<0.05。

2.3 各组不同时间点透析液丙酮酸水平比较 与同组冷缺血0 h比较，C0组、F0组冷缺血4～12 h透析液丙酮酸水平均升高，C30组、F30组冷缺血6～12 h透析液丙酮酸水平均降低(P均<0.05)；随着冷缺血时间的延长，F30组透析液丙酮酸水平呈降低趋势，其余三组无明显变化趋势。F30组冷缺血0～6 h透析液丙酮酸水平均高于其余各组同时间点(P均<0.05)。见表3。

表3 各组不同时间点透析液丙酮酸水平比较

注：与同组冷缺血0 h比较，*P<0.05；与C0组同时间点比较，#P<0.05；与F30组同时间点比较，△P<0.05。

2.4 各组不同时间点透析液乳酸/丙酮酸比较 与同组冷缺血0 h比较，C0组冷缺血1～12 h透析液乳酸/丙酮酸均降低，C30组、F30组冷缺血4～12 h透析液乳酸/丙酮酸水平均升高(P均<0.05)。与C0组同时间点比较，其余各组冷缺血1～12 h透析液乳酸/丙酮酸均升高，以F30组升高最明显(P均<0.05)。见表4。

表4 各组不同时间点透析液乳酸/丙酮酸比较

注：与同组冷缺血0 h比较，*P<0.05；与C0组同时间点比较，#P<0.05；与F30组同时间点比较，△P<0.05。

2.5 各组不同时间点透析液甘油水平比较 随着冷缺血时间的延长，C0组透析液甘油水平先降低后升高，其余各组均呈升高趋势。与C0组同时间点比较，其余各组冷缺血1～12 h透析液甘油水平均升高，以F30组升高最明显(P均<0.05)。见表5。

表5 各组不同时间点透析液甘油水平比较

注：与同组冷缺血0 h比较，*P<0.05；与C0组同时间点比较，#P<0.05；与F30组同时间点比较，△P<0.05。

3 讨论

脂肪肝的脂肪变程度与肝移植后不良反应的发生密切相关，脂肪变程度决定了供肝能否用于移植手术。临床上常规诊断脂肪肝的方法包括BMI、腰臀比、血清TG水平、超声、CT、MRI和病理切片等。病理切片是判断脂肪肝的金标准[6]，但病理判断脂肪变程度比较主观，很难定量，对病理医师的经验要求高，而且切片厚度、染色技术等均可能对判断脂肪变程度产生影响[7]。微透析技术以透析原理作为基础，通过插入生物体内的微透析探头在非平衡条件下进行灌流，物质沿浓度梯度扩散，使被分析物质穿过细胞膜扩散进入透析管内，并被透析管内连续流动的灌流液不断带出，从而达到活体组织取样的目的[8]。微透析系统由微透析导管、微量注射泵、微量收集瓶和微透析分析仪组成，微透析导管通过模拟毛细血管的被动转运功能来监测组织液的物质成分变化。在肝移植领域，微透析技术已逐渐应用于临床肝移植术前准备和术后监测，且应用前景良好。研究表明，肝脏热缺血1 h为供体使用极限，脂肪肝冷缺血6 h为供体使用极限，而正常肝脏冷缺血时间也不能超过24 h[9]。因此，本研究选择心跳停止后30 min作为热缺血时间，冷缺血时间选择12 h作为研究时间上限，微透析检测每隔2 h进行取样，分析指标包括反映细胞能量代谢的相关指标葡萄糖、乳糖、丙酮酸、乳糖/丙酮酸以及反映细胞膜损伤的相关指标甘油，以研究脂肪肝及缺血对肝脏功能的影响。

糖代谢主要是指葡萄糖在体内通过一系列复杂的化学反应产生能量的过程，在缺氧条件下机体则通过糖酵解生成乳酸，产能效率低于有氧氧化。糖酵解最主要的生理意义在于迅速提供能量，其代谢反应过程可分为两个阶段，第一阶段是葡萄糖分解成丙酮酸的过程，称为酵解途径，第二阶段是丙酮酸转变成乳酸的过程。糖酵解反应均在细胞质中进行，最终生成乳酸[10]。在葡萄糖的无氧代谢过程中，涉及到巴斯德效应，即有氧氧化抑制糖酵解的现象。当组织氧供充足时，有氧代谢抑制糖酵解，产生能量提供组织活动所需；缺氧时丙酮酸不能进入三羧酸循环，在细胞质中转变成乳酸，而丙酮酸和乳酸可通过弥散的方式通过细胞膜渗透到细胞外液中，从而可以被微透析仪器监测到[11]。因此，监测葡萄糖和乳酸水平可以反映肝组织内进行的是有氧代谢还是无氧代谢，监测丙酮酸水平可以反映肝脏代谢的能量是否充足[12,13]。乳酸水平和乳酸/丙酮酸能够反映组织葡萄糖酵解和无氧代谢的程度，也是反映细胞缺血缺氧的标志物[14]。当细胞主要依靠无氧酵解供能时，乳酸水平升高，而丙酮酸水平下降，二者比值则升高，提示氧气和葡萄糖供应不足[15]。本研究微透析结果显示：①各组透析液葡萄糖水平均随冷缺血时间均下降，说明冷保存过程中肝脏正在利用暂存的葡萄糖进行能量代谢，各组下降趋势一致，没有明显差异。②C0组和C30组乳酸水平维持较低水平，说明正常肝脏具备一定的抗缺血缺氧的能力。C30组乳酸水平高于C0组，说明热缺血导致肝脏进入无氧酵解，生成乳酸。F0组乳酸水平高于C0组，并随冷缺血时间的延长逐渐升高，说明脂肪肝耐受缺血缺氧能力差，冷缺血后迅速进入无氧酵解方式进行能量供应，丙酮酸生成乳酸，造成乳酸持续升高。F30组热缺血后乳酸水平即显著升高，在冷缺血过程中无明显变化，但整体水平显著高于其他各组;这说明F30组冷缺血前的热缺血阶段已经迅速启动无氧酵解产生能量，30 min的热缺血过程几乎耗尽了脂肪肝所有的能量代谢底物，丙酮酸生成大量乳酸，造成乳酸堆积而自身又无法清除，因此肝脏处于能量缺乏状态。③F30组冷缺血0～6 h透析液丙酮酸水平均高于其余各组同时间点，且在热缺血后即上升到很高水平，并随时间延长呈下降趋势；这说明热缺血造成了有氧代谢缺失，无氧酵解发生，产生大量丙酮酸，随着冷缺血时间的延长，丙酮酸代谢生成乳酸，乳酸增加而丙酮酸减少；同时脂肪肝耐受缺血的能力差，比正常肝脏更敏感。④各组乳酸/丙酮酸变化情况与乳酸表现相似，但C30组该比值随冷缺血时间升高，而F30组不仅热缺血后比值高且随着冷缺血时间延长而继续升高，因此热缺血脂肪肝不耐受缺血缺氧损伤的表现更加明显。因此，对于正常肝脏30 min的热缺血和12 h的冷缺血并未引起肝脏明显的代谢异常，肝脏对缺血缺氧的耐受能力以及修复能力可以使其仍能基本维持一个比较正常的代谢状态;但是,脂肪肝对缺血缺氧损伤的耐受力差，无法完成这种适应性调节，代谢相关指标水平改变显著，缺氧状态明显。

甘油可反映细胞损伤，其主要在脂肪酸和磷脂代谢中释放。磷脂是细胞膜的主要成分，能量缺乏使钙内流和磷脂酶类激活，导致甘油从细胞膜磷脂中脱离，甘油释放意味着细胞膜损伤[16]。研究表明，连续监测肝脏透析液中的甘油水平能够在移植前评估细胞膜损伤程度[17]。本研究结果显示，随着冷缺血时间的延长，C0组透析液甘油水平先降低后升高，其余各组均呈升高趋势；与C0组同时间点比较，其余各组冷缺血1～12 h透析液甘油水平均升高，以F30组升高最明显；这说明脂肪肝和热/冷缺血均会导致肝细胞膜损伤，且多种损伤因素同时存在会加重肝损伤。因此，在冷缺血中加强对肝细胞膜的保护可以减轻肝功能损伤，改善肝移植患者预后。甘油水平监测有助于更好地评估肝移植过程中肝脏总体的损伤情况，早期评估肝脏质量可避免使用较差质量的移植肝进行移植。

综上所述，脂肪肝大鼠热缺血后透析液葡萄糖水平降低，乳酸/丙酮酸、甘油水平升高，并随冷缺血时间延长而加剧；脂肪变和缺血均会造成肝细胞损伤和肝脏代谢能力下降，两种因素共同作用可导致肝损伤加重。微透析技术可以定量、敏感、持续并快速检测供体损伤情况，是移植前供肝质量评估实时、准确的评价方法，值得推广。