黑曲霉Aspergillus niger NCUF413.1对特香型白酒酿造出酒率和风味的影响

潘菲，董彪，刘婷，陈妍，陈可丹，黄冰静，万茵，刘成梅，张鹏，付桂明*

1(食品学院食品科学与技术国家重点实验室(南昌大学)，江西 南昌，330047)2 (江西省樟树市樟树贡酒业有限公司，江西 樟树，331200)

中国白酒是采用典型的同步糖化发酵的固态酿造方式生产，霉菌的糖化作用与淀粉原料的转化息息相关。固态发酵对原料的利用率低，淀粉质原料的糖化发酵不完全，是造成白酒固态发酵产酒率较低的重要原因。大曲是白酒酿造过程中微生物主要来源之一[1]，其含有的大量霉菌能够分泌多种淀粉酶、糖化酶等水解酶类[2]。这些酶能将淀粉水解成小分子糖，为酵母菌乙醇发酵及香气物质的生成提供能量和小分子物质[3]，直接影响白酒出酒率和重要香气物质的产生，对整个酿造过程产酒精和呈香有重要贡献。米曲霉、河内白曲霉、黑曲霉和米根霉等霉菌是白酒生产中常用的霉菌，具有较高的糖化力[4-5]，同时其具有耐酸特性且能分泌较多酸性蛋白酶，能够提高出酒率，已被广泛应用于白酒酿造。

本文对特香型白酒大曲中的霉菌进行分离纯化，筛选鉴定高产糖化酶霉菌，将其与酿酒酵母共同制备成麸曲强化大曲，接种于酒醅，按特香型白酒酿造工艺进行强化酿造，分析高糖化力霉菌对提高白酒固态发酵出酒率和原酒中风味物质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

特香型中温大曲、大米、稻壳，江西樟树贡酒厂有限公司。土豆、麸皮等，市购；淀粉、酵母膏、NaCl、NaOH、(NH4)2SO4、I2、KI、醋酸钠、冰醋酸、柠檬酸、柠檬酸钠、3,5-二硝基水杨酸、苯酚、Na2SO3、酒石酸钾钠等(国产分析纯)；乳酸石炭酸棉蓝染液,厦门海标科技有限公司；真菌DNA提取试剂盒、Taq酶,天根生化科技(北京)有限公司；葡萄糖(BR纯度),上海阿拉丁生化科技股份有限公司；琼脂粉(AR纯度),北京索莱宝科技有限公司；DNA Marker,宝日医生物技术有限公司；4-甲基-2-戊醇,德国Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 培养基和菌种

PDA培养基：称取200 g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水煮烂，用4层纱布过滤，加入葡萄糖和琼脂，加热搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1 000 mL，121 ℃灭菌15 min。

糖化力初筛培养基：可溶性淀粉12 g，酵母膏8 g，NaCl 5 g，琼脂 15 g，水1 000 mL。

麸皮培养基：新鲜麸皮10 g，加水15 mL，装于250 mL三角瓶中，0.12 MPa高压灭菌40 min，重复进行2次灭菌。

SaccharomycescerevisiaeNCUF303.1 为本实验保存的高产酒精酿酒酵母。

1.3 仪器与设备

ZDX-35BI型坐式蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；HWS-250型恒温恒湿培养箱,上海森信实验仪器有限公司；DYY-8C型电泳仪，北京市六一仪器厂；PCR仪，赛默飞世尔科技有限公司；7890-7000 GC-QQQ-MS，美国Agilent公司；57330-U SPME手柄、50/30 μm二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷 固相微萃取纤维头，美国Supelco公司。

1.4 实验方法

1.4.1 特香型白酒大曲中霉菌的分离纯化[6]

将5 g大曲粉置于含有100 mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，稀释涂布于PDA培养基上，置于28 ℃下恒温培养2～3 d，将选中的菌落进行传代培养，并通过反复划线进行纯化。

1.4.2 特香型白酒大曲中高糖化霉菌的筛选

将霉菌点种于初筛培养基，28 ℃培养2～3 d，向培养皿中加入适量显色剂染色。静置，测量平板中菌落和透明圈的直径大小，计算水解圈(hydrolysis cirole,HC)值(HC=透明圈直径/菌落直径)，以HC值的大小作为衡量糖化力强弱的标准。

菌株经斜面活化后，用血球计数板计数后稀释至孢子数达107CFU/mL,接种于麸皮培养基中，28 ℃培养72 h，采用DNS试剂法测定糖化酶酶活，采用Young J.Yoo改良法测定α-淀粉酶活[7]。

1.4.3 真菌菌落、生化鉴定

采用插片法对复筛霉菌的菌落形态进行显微形态结构观察，参照真菌分类鉴定手册，初步确定菌株分类。

1.4.4 霉菌分子鉴定

采用真菌基因组DNA提取试剂盒步骤提取霉菌DNA。以上述提取的霉菌基因组DNA为扩增模板，进行PCR扩增，将PCR产物送往上海生工生物工程股份有限公司测序。测序结果在GenBank上进行比对，鉴定种属。

1.4.5 麸曲的制备应用分析

取筛选得到的高糖化力霉菌和实验室保存的1株酿酒酵母，以麸皮培养基制备强化麸曲。根据酒厂的实际生产工艺，功能麸曲加入量占大曲总量13%，将其与粉碎的大曲一起添加到冷却的粮醅中，其中曲占酒糟的比例为20%，加入后需充分搅拌均匀。其中实验A组为霉菌和酵母共同添加，B组和C组分别添加霉菌和酵母，D组为对照组。

将不同实验组应用于模拟特香型白酒酿造体系中，发酵周期为30 d，蒸馏得酒样，并进行分析，酿酒实验重复3次。

1.4.6 酒样指标分析

(1)出酒率按照中国酿酒工业学会定义，按公式(1)计算:

(1)

式中：m,产50%(vol)酒样质量,g;M,大米的质量，g。

(2)酒精度按照国标 GB 5009.225—2016测量酒样的酒精度。

(3)挥发性成分分析

A.HS-SPME条件。取5 mL酒样于顶空瓶中，添加10 μL 4-甲基-2-戊醇内标溶液，萃取参数分别为5%酒精度、0.2 g/mL NaCl、萃取温度50 ℃、萃取时间30 min。萃取结束后，插入气相进样口热解析5 min后拔出，并分析检测。每个样品平行3次。

B.GC-MS条件。气相色谱柱：HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气：He；流速1 mL/min；分流比10∶1；进样口温度250 ℃；升温程序：起始。

质谱条件：电子能量70 eV，离子源EI，离子源温度230 ℃，质量扫描范围28～500 amu，扫描方式为全扫描。

C.酒样挥发性成分RI和含量的测定。定性分析：将正构烷烃标准品液体进样，按上述酒样升温程序进行分离，进样量为1 μL，分流比为10∶1。根据每个正构烷烃出峰的保留时间来计算样品组分峰的保留指数RI[8]。与质谱库中的化合物进行匹配。定量分析：以内标物质(4-甲基-2-戊醇)的浓度、峰面积计算各挥发物的含量,重复测量3次。

2 结果与分析

2.1 糖化霉菌的分离、筛选

从73株霉菌菌株初筛出HC较大的14株霉菌，测定其糖化酶、液化酶酶活，结果如图1所示。

由图1可知，菌株NCU-69的糖化酶和液化酶酶活均高于其他菌株，液化酶活力最强为631.96 U/g，糖化酶活力为938.63 U/g，综合考虑选定其为目标菌株。

2.2 糖化霉菌的鉴定

2.2.1 霉菌的形态及鉴定

利用插片法对其进行培养，利用乳酸石碳酸棉蓝染液对其染色制片，在显微镜下观察的菌株形态特征如图2所示。

图2显示，从形态特征上，NCU-69菌落表面为黑褐色、粉末状，菌落生长快；分生孢子头的顶囊球形状为近球形、黑褐色、呈放射状排列，孢子呈链状、布满顶囊；分生孢子梗较长，表面光滑、无隔，这些都符合曲霉属的形态特征。

2.2.2 菌种的分子生物学鉴定

将获得的NCU-69菌株的DNA序列在NCBI数据库进行比对，结合菌落形态和显微形态，鉴定NCU-69为黑曲霉(Aspergillusniger)，命名为NCUF413.1。

2.3 糖化霉菌应用性能分析

2.3.1 糖化霉菌酒样理化指标测定

将不同菌种组合麸曲强化大曲酿造的酒醅进行蒸馏，测酒样酒精度折算成出酒率，结果如表1所示。

与对照组酒样比较，A组出酒率由26.21%提高到34.35%。其原因可能是强化的A.nigerNCUF413.1和S.cerevisiaeNCUF303.1协同作用，强化的黑曲霉分泌糖化酶和液化酶加速了对原料糖化分解，被酿酒酵母利用转化为酒精。B组单独用A.nigerNCUF413.1强化出酒率比对照组提高0.8%，这是由于A.nigerNCUF413.1水解淀粉成小分子糖还原糖，在白酒酿造过程中，为酒醅中原有酿酒酵母乙醇发酵提供了还原糖[9]，从而提高了出酒率。而C组单独用S.cerevisiaeNCUF303.1强化时，出酒率却下降了，原因可能是强化了酿酒酵母，在酿造前期快速生成乙醇对霉菌的生长有抑制作用[10]，反而降低了淀粉的水解。

2.3.2 功能霉菌强化酒样香气成分测定

采用GC-MS对A组和对照组酒样中的挥发性成分进行分析，酒醅固相微萃取物质质谱总离子流色谱图如图3所示。

将不同菌种强化酒样依次测定挥发性成分，如图3所示，3种强化酒样与对照组酒样总离子流色谱图基本相似，各酒样中挥发性成分峰形一致，说明不同酒样中香气成分种类基本一致。

对总离子流图中的各峰与数据库MPW2011和NIST11标准质谱图库进行比对，结合保留指数定性，不同菌种强化酒样中挥发性成分的含量结果见表2。

由表2可知，经GC-MS从A、B、C和对照组酒样中分别鉴定出67、66、66和67种挥发性成分，只有A组黑曲霉和酿酒酵母共强化的酒样与对照组中挥发性成分种类完全一致。67种挥发性成分包括酸类物质2种，醇类物质9种，酯类物质36种，醛酮类物质16种，烃类化合物4种等。其中苯乙醇、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙酸乙酯、苯乙酸苯乙酯、苯丙酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、棕榈酸乙酯、苯乙醛和3-糠醛的含量较高，其总离子流图响应值明显高于其他物质。相关的研究表明[37]，特香型白酒中的特征香型物质主要为奇数脂肪酸乙酯等酯类物质，如乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、棕榈酸乙酯、癸酸乙酯等，这与本次研究结果相似。

注：n.d表示未检出或含量较低，RI≥700开始检测

白酒中酸类、醇类、酯类和醛酮类等众多微量呈香物质是决定白酒风格和质量的关键因素。其中，酯类化合物是白酒产品中最重要的呈香物质之一，也是酒香浓郁的主要物质，酯类化合物在总挥发性物质中比例高低对白酒香味浓郁起重要作用。结果表明，A.nigerNCUF413.1强化可提高酿造的酒样中总酯含量，单独黑曲霉强化酒样酯类化合物含量占总挥发性物质的70.11%，A组黑曲霉和酿酒酵母酒样中酯类化合物含量占总挥发性物质的71.01%，均高于对照组的62.94%。A组酒样中丁酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、丁二酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯、油酸乙酯等酯香风味物质的含量均高于对照组。HUANG Y等[38]从茅台酒大曲中分离出一株黑曲霉，通过研究该菌蛋白酶对茅台酒香气的影响发现黑曲霉产酶能提高酒样中醇和酯类的含量。

3 结论

从特香型白酒大曲中筛选得到1株高糖化酶力菌株A.nigerNCUF413.1，与S.cerevisiaeNCUF303.1共同制作强化麸曲，按特香型白酒酿造工艺进行强化酿造发现，出酒率由26.21%提高到34.35%，挥发性成分种类一致，其中丁酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、丁二酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、棕榈酸乙酯亚油酸乙酯、油酸乙酯等酯类化合物含量升高，其占总挥发性成分比例提高了8.07%。产糖化酶霉菌A.nigerNCUF413.1与酿酒酵母共同强化酿造，有助于白酒发酵中酯类物质的产生，提高出酒率，提高白酒酯香风味成分含量。