中国固态发酵白酒中功能细菌研究进展

郭学武，范恩帝，马冰涛，李泽霞，张煜行，张志民，陈叶福，肖冬光*

1(河北衡水老白干酿酒(集团)有限公司，河北 衡水,053000) 2(工业微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学 生物工程学院，天津,300457) 3(中国轻工业浓香型白酒固态发酵重点实验室，四川 宜宾，644007)

白酒是中华民族的瑰宝，也是中华民族文化重要的载体，凝聚着我国古代劳动人民的智慧，至今已经有几千年的历史。与世界其他国家的蒸馏酒相比，中国白酒独具风格，具有丰富的不可比拟的风味，一是由于它的独特工艺，二是由于丰富的微生物参与了白酒发酵[1]。

白酒属于发酵食品，发酵离不开微生物的作用。细菌、霉菌和酵母是白酒酿造3大类微生物，在白酒生产中起着至关重要的作用。细菌是一类重要的白酒酿造微生物，目前白酒中报道的主要功能细菌及其主要代谢产物见图1和表1。白酒功能细菌主要分布于酒曲、酒醅和窖泥，且以酒曲中最为丰富。白酒酒醅与窖泥中的细菌微生物种类及数量虽不及酒曲，但也含有较为丰富的细菌微生物，酒醅中的细菌源自于酒曲、窖泥和生产环境，窖泥中的细菌一方面来自于酒曲与酒醅，另一方面则是来自于制作窖泥的土壤，它们对窖泥香气、白酒质量、白酒产率等均有影响[2]。因此深入研究白酒中的细菌微生物具有重要的意义，不仅可以阐明细菌在白酒生产各个环节中的作用，诠释白酒中细菌来源的微量成分，也可以进一步通过控制细菌微生物，科学地管理白酒生产，进而提升白酒品质。

白酒的酿造方式是多微共酵，因此科学认识各种微生物在白酒中的作用，对于阐明白酒中复杂物质的来源，科学提高白酒品质与内涵，提升白酒安全性有着非常重要的意义。细菌是白酒发酵中一类关键的、有着重要功能的微生物。鉴于近年来微生物技术的发展，白酒细菌微生物的研究也越来越深入，对各种细菌在白酒中的作用也得到了进一步的认识，本文综述了近年来白酒功能细菌的研究进展，介绍了酿酒各个环节中主要功能细菌及其在白酒中的作用，旨在为白酒功能细菌的研究提供参考。

1 酒曲中功能细菌的研究

1.1 大曲中的细菌

大曲是以小麦、大麦和高粱等为原料经粉碎制块和自然接种而制成，大曲在白酒中应用广泛，浓香型、清香型、酱香型和兼香型白酒等均以大曲作为酒曲，在白酒生产中主要作为糖化剂和发酵剂，根据生产温度不同可分为高温大曲、中温大曲和低温大曲，且每种大曲的微生物群落差别巨大。大曲作为白酒发酵生产的动力，主要是由于大曲中丰富的微生物群落，而这其中更是少不了细菌的参与(主要细菌种类见表1)，并且大曲中的细菌微生物十分丰富，大曲中的主要细菌微生物为放线菌(53.85%)和成团泛菌(Pantoeaagglomerans，19.23%)，除此之外还包括芽孢杆菌、醋酸杆菌、乳酸菌等[3]。

酱香型白酒大曲是典型的高温大曲，浓香型白酒大曲是典型的中温大曲，清香型白酒大曲是典型的低温大曲，国内对于3类白酒大曲中的细菌多样性研究较多，如WANG等[4]研究发现茅台大曲中细菌微生物主要是由芽孢杆菌、乳酸杆菌和梭菌等组成，其中芽孢杆菌最为丰富；WANG等[5]从3种酱香型白酒大曲中共检测出35种细菌，这些菌分别属于放线菌、孢子菌和链霉菌等科；FAN等[6]经研究指出泸型白酒大曲原核微生物主要包括乳杆菌属、巴氏杆菌属、芽孢杆菌属和双歧杆菌属等；ZOU等[7]研究发现浓香型白酒大曲中的细菌主要包括芽孢杆菌属、乳杆菌属、假单胞菌属、肠杆菌属和葡萄糖球菌属等；ZHENG等[8]利用变性梯度凝胶电泳技术(polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)从汾酒大曲中分离鉴定出109株细菌，包括法国乳杆菌、产气肠杆菌和大型芽孢杆菌等；ZHANG等[9]通过对汾酒3种大曲的磷脂肪酸谱进行研究，发现清茬曲和后火曲中细菌所占比例均高于红心曲，并推测是由于红心曲中存在红曲霉导致，同时也发现了白酒酸度、出酒率等与细菌有关。除各个白酒香型工艺不同导致大曲细菌微生物种类有差异外，大曲的生产地点对于细菌微生物种类也有一些影响，如南方大曲中存在没食子酸葡萄球菌和腐生葡萄球菌，而北方大曲则没有[10]。

白酒大曲中的细菌对于白酒质量提高有着关键作用，它们具有以下功能，一是参与白酒生产主要代谢途径，如LUO等[11]从泸型大曲中分离出1株嗜热葡萄球菌，具有产酯化酶功能；地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)等可以产生α-淀粉酶、糖化酶脂肪酶和蛋白酶[12]；枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等可以产生正戊醇、异丁醇、2,3-丁二醇等[13]；融合魏氏菌、枯草芽孢杆菌等可以合成乳酸、乙酸、丙酸等[13]。二是丰富白酒有益成分，如地衣芽孢杆菌功能大曲用于生产白酒，可以显著提高吡嗪、萜烯等的含量，还可以产生地衣素[14]；从高温大曲中分离得到的枯草芽孢杆菌可以产生乙偶姻、四甲基吡嗪等[15]。三是改善白酒风味，如枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和短小芽孢杆菌等可以抑制链霉菌生长，进而减少土臭素以控制白酒的土臭味[16]；地衣芽孢杆菌产生的地衣素可以增强酯类等物质的挥发性，并且能显著降低苯酚和苯乙醇等异嗅物质的挥发性，同时还能产生吡嗪、愈创木酚等呈香物质[14]；醋杆菌和氧化葡萄杆菌等醋酸菌可以提高白酒酸酯产量；链霉菌属的放线菌具有产生酸、酯、醛等物质的能力[17]；融合魏氏菌等乳酸菌不仅可以合成乳酸、乙酸等，还能促进乳酸乙酯的生成。

1.2 小曲中的细菌

小曲常见于南方，主要生产原料为米粉和米糠等，种类较多，可根据有无中草药、原料、形状和用途等进行分类，各地对于小曲也有不同的称呼，如白曲、米曲、酒饼、观音曲等。小曲虽然只是人为接种了霉菌和酵母菌，但小曲白酒常在开放式环境下生产，所以小曲中的细菌微生物也比较丰富(主要细菌种类见表1)，包括乳杆菌属、沙雷氏菌属和黄单胞菌属等，其中优势细菌为乳酸菌(50%)[3]。

国内对于小曲中细菌群落有较多研究，WU等[18]利用高通量测序技术在3个地区的小曲中共检测到17种细菌，并发现不同地区小曲的优势微生物和细菌种类均有所不同；王海燕等[19]利用PCR-DGGE技术研究湖北清香型小曲微生物多样性，发现小曲优势细菌为西贝利亚魏氏菌(Weissellacibaria)、梭菌、假单胞菌(Pseudomonas)等；WANG等[20]发现传统小曲(酒饼、饼丸)与机制散曲细菌多样性相似但高于机制散曲，传统小曲优势菌为乳酸杆菌属、片球菌属、魏氏菌属和醋酸杆菌属等，机制散曲以乳酸杆菌属、片球菌属、不动杆菌属和芽孢杆菌属等为主，同时也指出由于散曲生产机器不完善，散曲中存在克雷伯氏菌和肠杆菌等病原菌；冯春等[21]对湖南和湖北多个酒厂小曲中的细菌进行分析鉴定，每克小曲细菌数量达到108个，其中以葡萄球菌属、微球菌属、酒明串珠菌属等为主要细菌。

小曲中含有大量的功能细菌，主要具有以下功能。一是参与白酒生产主要代谢途径，如枯草芽孢杆菌可以产生α-淀粉酶、糖化酶脂肪酶等参与白酒发酵[12]；嗜热葡萄球菌可以产生酯化酶促进白酒酯类物质的合成[11]；部分乳酸菌可以参与白酒中乙醇等主要物质的合成。二是抑制杂菌，如乳酸菌及其产物可以抑制有害菌；蜡样芽孢杆菌可以产生抑菌素防止阻尼病[22]；路氏肠杆菌(Enterobacterludwigii)对白色念球菌等多种病原菌均具有抑制作用[23]；枯草芽孢杆菌可产生20多种抗生素，能抑制多种有害微生物[24]。三是增加白酒风味，如小曲的优势细菌-乳酸菌可以产生乳酸，进而促进呈香物质乳酸乙酯的生成，枯草芽孢杆菌可以产生甲酯类物质，蜡样芽孢杆菌经自身代谢活动可以产生己酸乙酯[13]。

1.3 麸曲中的细菌

麸曲一般是以麸皮为原料接种纯种霉菌(曲霉、根霉等)制成的，具有生产周期短、出酒率高等特点，在白酒生产中主要起糖化作用，一般需要与酵母一起使用。麸曲生产过程中只是人为接种了霉菌，所以麸曲中细菌数量和种类相对较少(主要细菌种类见表1)，它们主要来自于白酒生产环境中，GOU等[3]在麸曲中发现的细菌包括枯草芽孢杆菌(3.33%)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus，3.33%)、蜡样芽孢杆菌(16.67%)、贝氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii，23.33%)和屎肠球菌(Enterococcusfaecium，46.67%)。

麸曲中虽然细菌数量不多，但是也存在一些功能细菌，具有以下功能：一是参与白酒生产主要代谢途径，如贝氏梭菌可以参与丁醇的合成[23]；蜡样芽孢杆菌可以产生己酸乙酯等呈香物质[25]；枯草芽孢杆菌可以产生α-淀粉酶、糖化酶脂肪酶等参与白酒发酵，还能够产生琥珀酸，从而降低乳酸等功能[12,26]。二是抑制有害菌，如屎肠球菌作为一种人体益生菌，可以抑制大肠杆菌、沙门氏菌等肠道病原菌，也可以用于治疗腹泻，改善肠道健康等；戊糖片球菌可以产生一种蛋白质细菌素，可以有效抑制李斯特菌等有害微生物。

白酒麸曲均为人工接种，传统麸曲仅接种纯种霉菌，导致其中的细菌种类较少，但是由于麸曲具有生产周期短、出酒率高等优点，所以细菌麸曲已经被研究用于生产多种香型白酒，如谢国排等[27]在麸曲中添加耐高温且具有产蛋白酶能力的地衣芽孢杆菌，最终提高了芝麻香等香型白酒的出酒率与质量；赵德义等[28]将添加了嗜热芽孢杆菌的麸曲用于生产芝麻香型白酒，成品白酒优级品率提高了23%；赵希玉等[29]从茅台大曲中从筛选出6株具有产酱香功能的嗜热芽孢杆菌制作麸曲，再混合河内白曲、生香酵母曲，用于生产酱香型白酒，成品白酒风格独特且兼有酱香型白酒特点。

2 酒醅中功能细菌的研究

酒醅是由蒸煮的粮谷原料(高粱、小麦、糯米等)与酒曲2部分混匀组成，酒醅在酒窖中经过酒曲微生物的发酵作用，再通过蒸馏即可生产白酒，在浓香型白酒生产过程中酒醅又直接与窖泥和空气接触，窖泥和空气中的微生物可以直接迁移到酒醅中，故而酒醅中的微生物会与酒曲、窖泥和空气中的微生物有所关联，并且上层酒醅微生物数量更加丰富，说明酒醅微生物多数可能为好氧菌或是兼性厌氧菌。

与酒曲和窖泥相比，国内对于白酒酒醅中的细菌微生物的相关研究较少，但是酒醅中的细菌直接参与白酒生产，并且其代谢物会对白酒风味有好有坏的影响，所以研究酒醅中的细菌对保证白酒质量会起到巨大的作用。每种香型白酒由于生产环境和工艺的不同，导致细菌种类和丰富度有所不同，各香型白酒酒醅细菌及其研究现状见表2。

白酒酒醅发酵结果的好坏很大程度上决定了白酒质量，而对酒醅发酵影响最大的就是其中的微生物，细菌自然被包括在这些微生物中，在各个香型白酒酒醅中均有发现细菌(主要细菌种类见表1)，这些酒醅细菌在白酒生产中起着关键作用，一是参与白酒生产主要代谢途径，如泸型白酒酒醅中存在较大比例的梭菌(最高可达6.67%)，梭菌可参与氨糖、果糖等的代谢[37]；产色高温单胞菌(Thermomonosporachromogena)具有降解淀粉、纤维素和蛋白质的能力；枯草芽孢杆菌具有产纤维素酶的能力[38]；解淀粉芽孢杆菌可产生氨基甲酸乙酯水解酶用于降解致癌物质—氨基甲酸乙酯。二是增加白酒风味，如酒醅梭菌可以合成丙酸、丁酸和丁酸乙酯，赋予白酒菠萝香气[37,39]；乳酸菌可以促进乳酸乙酯的产生；地衣芽孢杆菌产生的地衣素可以降低异嗅物质的挥发性，改善白酒风味[14]；枯草芽孢杆菌可以产生吡嗪类物质，赋予白酒烘烤香气[40]。三是丰富白酒活性成分，如乳酸菌可以产生一种中性黏稠的胞外多糖[41]；枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌可以产生四甲基吡嗪、萜烯和地衣素等，同时枯草芽孢杆菌也能合成抗氧化活性肽[14,40]。

3 窖泥中功能细菌的研究

窖池是生产浓香型白酒的必要设备之一，在白酒生产行业众所周知的一句话是“千年老窖万年糟，酒好全凭窖池老”，优质浓香型白酒更离不开老窖，这主要是由于窖池底部的窖泥富含微生物，窖泥中的微生物可迁移到酒醅并参与白酒发酵。窖池使用时间越长，窖泥中的微生物越多，并且老窖池中的窖泥比人为陈化窖池中的窖泥香气强烈[42,43]。

窖泥微生物包括细菌和真菌(主要细菌种类见表1)，其中以革兰氏阳性菌和厌氧菌为主[43]。国内有许多研究者着力于分离筛选窖泥中的功能细菌和探究窖泥细菌群落，如CHAI等[44]经研究发现泸州老窖窖泥中的梭菌主要属于尾状梭菌科(32.0%，Clostridialesincertaesedis)、螺旋杆菌科(18.3%，Heliobacteriaceae)和梭菌科1(8.4%，Clostridiaceae1)，而氢孢菌属(Hydrogenispora)、沉积杆菌属(Sedimentibacter)和梭菌属(Clostridium)是梭菌的主要属，同时分离到19种具有产丁酸能力的梭菌，其中有10种是首次从窖泥中分离到；LIU等[45]从泸型酒窖泥中分离到1株新型厌氧膨胀梭菌，可以葡萄糖等为原料发酵产生乙醇、乙酸和丁酸等；HU等[46]从泸州老窖等浓香型白酒厂窖泥中分离到15株梭菌属和8株芽孢杆菌属，均具有产己酸等能力；ZHANG等[47]利用PCR-DGGE技术从泸型白酒窖泥中鉴定了14个属的细菌，包括梭菌属、芽孢杆菌属、乳酸菌属、葡萄球菌属等；ZOU等[7]研究指出窖泥中的细菌主要包括梭菌属、乳杆菌属、芽孢杆菌属、放线菌属等，其中优势菌为梭菌属，常见的包括膨胀梭菌、丁酸梭菌等。

窖泥细菌不仅种类丰富，在白酒生产中也起到关键作用。一是参与白酒生产主要代谢途径，如苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌可以产生内肽酶、氨肽酶、羧肽酶参与白酒生产；解淀粉芽孢杆菌能产生2种淀粉酶、糖化酶和脱支酶；吲哚梭菌(Clostridiumindolis)和产孢梭菌(Clostridiumsporogenes)等可以合成1-葵醇、正辛醇、十一烯醇和苯乙醇等醇类；膨胀梭菌能利用葡萄糖等底物产生乙醇[45]；梭菌和芽孢杆菌通过丁酸激酶途径合成丁酸，同时梭菌也可以通过丁酰辅酶A:乙酰辅酶A转移酶途径合成丁酸[44]。二是增加白酒风味，如克氏梭菌可以合成己酸、丁酸、辛酸及3者对应的乙酯产物[46]；梭状芽孢杆菌可以产生短链脂肪酸、乙醇等物质，而短链脂肪酸与乙醇反应又可以进一步合成己酸乙酯、丁酸乙酯等呈香物质，地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等可以产生乙偶姻和2,3-丁二酮等物质，促进白酒香气和甜味的产生[48]；甲烷菌(Methanobacteria)在合成甲烷的同时也会促进乙酸、己酸、己酸乙酯等的产生[49]；链霉菌属为主的放线菌具有产生丁酸乙酯、己酸乙酯和丁烯酸甲酯等的能力[17]。

4 展望

白酒酿造微生物是近年来备受关注的研究领域，白酒酿造过程中的细菌及其功能是其中极为重要的研究内容之一。白酒生产过程中，微生物是固态发酵生产白酒的基础，在这其中细菌对白酒的贡献尤为重要，酒曲、酒醅和窖泥中均有细菌存在，种类丰富且数量巨大。白酒功能细菌的研究涉及到多种细菌，它们在酿酒的各个环节通过自身或者其代谢产物影响白酒的品质和风味。同时，功能细菌的代谢还会影响其他白酒微生物如酵母和霉菌的代谢。目前研究某种细菌功能主要是针对单一菌株，且许多细菌的代谢产物及其代谢途径尚不清楚，而且还存在着很多较难培养或不可培养微生物，加上白酒自然发酵条件，种类繁多的微生物之间还存在相互作用，致使判断白酒中细菌的功能更加困难。由于整个白酒酿造体系涉及到多种细菌、酵母和霉菌的参与，同时细菌还与其他微生物之间相互作用，因此细菌对白酒的影响作用是错综复杂的。白酒酿造过程中的各微生物之间相互作用,共同构成了一个复杂、精细、微妙的白酒酿造微生物代谢网络。

因此,要阐明细菌在白酒生产中的作用与机理就需要着眼于一个新的角度即微生物的群体效应,在白酒酿造体系中，细菌、霉菌和酵母等微生物共同存在于一个发酵体系中，它们互相之间存在共处、互生、共生、拮抗、竞争等关系，而且这些微生物的代谢产物或中间产物也被互相利用。另一方面，白酒细菌的功能与机理研究也为其他研究者提供了新的启示，比如中国传统发酵食品中还有很多类似于白酒的发酵体系，如醋、酱油、豆瓣酱、辣椒酱等等，白酒功能细菌的研究也将为这些研究提供参考和借鉴。挑战与机遇并存,白酒功能细菌的研究仍需要大量具有指导意义的研究工作，以更好阐释白酒的内涵与价值。