醋酸菌对高产酯酿酒酵母酒精发酵及酯醇代谢的影响

张华东，郭学武，肖冬光*

1(天津科技大学 生物工程学院，天津，300457) 2(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津，300457)

醋酸菌属，革兰氏阴性好氧菌，主要包括16个属[1]，在白酒生产中最为常见的是醋酸杆菌属和葡糖杆菌属[2-3]。在酿酒过程中，醋酸菌多存在于堆积发酵阶段和入池发酵的前期，随着发酵的进行，氧气耗尽，醋酸菌逐渐凋亡[4-5]。

醋酸菌在白酒生产过程中对白酒风味的形成有一定的影响，醋酸菌产生的醋酸(又称乙酸)能使酒醅呈酸败味，酸度高会抑制酿酒酵母的生长，醋酸对微生物有较大的毒性[6]，但适量的醋酸对白酒的风味有一定的促进作用，醋酸是白酒的主要香味成分，同时也是酯的承受体[7]。有研究表明醋酸菌存在有利于酿酒酵母合成乙酸乙酯[8]，将酵母菌与醋酸菌混合发酵能使醋酸菌高产醋酸[9]。

白酒生产需要众多微生物菌群的参与，主要包括霉菌、细菌和酵母菌3大类[10-11]，其中酵母菌负责酒精发酵，酿酒酵母是酒精发酵的主体菌；同时酵母菌代谢产生的乙酸酯类和高级醇是白酒中主要的呈香物质[12-14]。白酒生产是微生物相互作用的结果，研究微生物相互作用对白酒酿造技术的进步有着重要的意义[15]。实验室前期通过分子生物学手段构建了1株高产酯酿酒酵母MY-15，该菌株不仅能够高产乙酸乙酯和乙酸异戊酯，而且酒精发酵能力与普通酿酒酵母无异。将高产酯酿酒酵母与白酒生产中常见的醋酸菌(巴氏醋杆菌)同时接种混合发酵，研究醋酸菌对高产酯酿酒酵母酒精发酵及酯醇代谢的影响，为白酒生产中高产酯酿酒酵母的实际应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

巴氏醋杆菌(Acetobacterpasteurianus)，筛选自白酒酒醅；高产酯酿酒酵母MY-15(CGMCC No.5635)，天津市工业微生物重点实验室保存。

1.1.2 主要试剂

MgSO4、(NH4)2SO4、K2HPO4(均为分析纯),天津市北方天医化学试剂厂；酵母膏(生化试剂),北京奥博星生物技术有限公司；葡萄糖(分析纯),天津光复精细化工有限公司；无水乙醇(分析纯),天津市江天化工技术股份有限公司；耐高温α-淀粉酶(酶活1×105U/mL)、糖化酶(酶活2.9×105U/mL)、酸性蛋白酶(酶活5×104U/mL),诺维信(中国)生物技术有限公司;玉米粉,超市购买;澳洲高粱,北京红星二锅头有限公司。

1.1.3 培养基

酿酒酵母种子培养基(玉米水解液)：玉米粉与水按照料液比1∶4(g∶mL)混合，添加耐高温α-淀粉酶(10 U/g原料)在90 ℃水浴作用1 h，然后继续加热煮沸30 min，之后补水至原体积，立即降温到60 ℃，添加糖化酶(250 U/g原料)在60 ℃水浴作用4 h，然后用4层纱布过滤，调节糖度为12 °Bx，添加(NH4)2SO46 g/L，MgSO41.2 g/L，K2HPO42.4 g/L，115 ℃高温灭菌20 min备用。

高粱汁发酵培养基：高粱粉与水按照料液比1∶3(g∶mL)混合，液化糖化步骤同玉米水解液，糖化完成后降温到40 ℃，添加酸性蛋白酶(30 U/g原料)水浴作用4 h，然后用4层纱布过滤，调节到所需糖度，115 ℃高温灭菌20 min备用。

醋酸菌培养基：葡萄糖20 g/L，酵母膏15 g/L，接菌前添加体积分数为3.5%的无水乙醇；固体培养基额外添加20 g/L琼脂和20 g/L CaCO3。

1.2 仪器与设备

MS204S电子天平,梅特勒-托利多仪器有限公司；1200系列高效液相色谱仪、7890B型气相色谱仪,美国安捷伦科技有限公司；XMTB型电热恒温水浴锅,天津市中环实验器材有限公司；H1650-W型高速冷冻离心机,湖南湘仪科技有限公司；BX43型生物显微镜,日本OLYMPUS会社；LDZM-60KCS立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂。

1.3 试验方法

1.3.1 醋酸菌的培养

醋酸菌种子液：从4 ℃冰箱保存的醋酸菌斜面上刮1环至装有醋酸菌液体培养基的试管中，装液量5 mL/20 mL,180 r/min,30 ℃培养24 h，得醋酸菌一级种子液。将一级种子液倒入装有醋酸菌液体培养基的三角瓶中,装液量100 mL/250 mL，8层纱布封口，180 r/min,30 ℃培养24 h，得醋酸菌二级种子液。

醋酸菌发酵液：取醋酸菌二级种子液10 mL接入装有醋酸菌液体培养基的三角瓶中，装液量100 mL/250 mL，8层纱布封口，180 r/min,30 ℃培养5 d，得醋酸菌发酵液。

1.3.2 高产酯酿酒酵母种子液的培养

从4 ℃冰箱保存的高产酯酿酒酵母斜面上刮1环至装有玉米水解液的试管中，装液量5 mL/20 mL,30 ℃培养24 h，得高产酯酿酒酵母一级种子液。将一级种子液倒入装有玉米水解液的三角瓶中,装液量100 mL/250 mL，棉塞加牛皮纸封口，30 ℃静置培养16 h，得高产酯酿酒酵母二级种子液。

1.3.3 醋酸菌菌悬液对高产酯酿酒酵母酒精发酵及酯醇代谢的影响

取醋酸菌二级种子液150 mL,在4 ℃下7 000 r/min离心5 min，弃上清液，然后向沉淀中加入16 °Bx高粱汁发酵培养基至总体积150 mL，振荡混匀，制成醋酸菌悬液，然后按照5、10、15、20 mL的接种量接种到16 °Bx高粱汁发酵培养基，高产酯酿酒酵母接种量都为10 mL，发酵总体积为130 mL/250 mL，在30 ℃静置发酵72 h。

1.3.4 醋酸菌发酵液对高产酯酿酒酵母酒精发酵及酯醇代谢的影响

取醋酸菌发酵液350 mL，在4 ℃下7 000 r/min离心5 min,取上清液，上清液过膜除菌，采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)测定醋酸含量(23 g/L)，然后用醋酸菌发酵上清液配制含有不同质量浓度(2、4、6、8 g/L)的醋酸高粱汁发酵培养基(表1)，高产酯酿酒酵母接种量都为10 mL，发酵总体积为130 mL/250 mL，30 ℃静置发酵72 h。

1.3.5 分析方法

乙酸检测：将样品离心并用0.22 μm的滤膜过滤到液相分析小瓶，使用Agilent 1200SL 液相色谱仪，色谱柱HPX-87H(300 mm×7.8 mm×9 μm)，紫外(ultra violet,UV)检测器，流动相为5 mmol/L的H2SO4溶液，柱温60 ℃，流速为0.6 mL/min，检测时间23 min，进样量20 μL。

高级醇、乙酸酯检测：将蒸馏后得到的样品使用气相色谱法测定，其色谱条件为Agilent 7890B气相色谱仪，氢火焰离子检测器(flame ionization detector,FID)，载气为高纯氮气，LZP930白酒分析专用毛细管柱(50 m×0.32 mm×0.25 μm)，进样量1 μL，分流比10∶1，进样口温度200 ℃，检测器温度230 ℃，氢气流量40 mL/min,空气流量300 mL/min，柱流量0.8 mL/min。程序升温，50 ℃保持8 min，然后以5 ℃/min速率升温到200 ℃保持5 min[16]。

残糖的测定：斐林试剂法[17]。

酵母菌计数：血球计数板法[18-19]。

2 结果与讨论

2.1 醋酸菌菌悬液对高产酯酿酒酵母酒精发酵及酯醇代谢的影响

按照1.3.3的方法，醋酸菌菌悬液对高产酯酿酒酵母酒精发酵的影响见表2，对酯醇代谢的影响见图1。由表2可知，发酵进行到12 h时，与酿酒酵母单独发酵相比，添加醋酸菌菌悬液的实验组对酵母的生长有所抑制，添加20 mL时比酿酒酵母单独发酵时酵母数下降了28%，可能跟醋酸菌与酵母竞争营养物质有关；发酵进行到24 h时，实验组与对照组相比酵母菌数相差不大，因为醋酸菌是好氧菌[20]，随着培养基内氧气的减少，醋酸菌生长受到抑制，酵母菌生长迅速。可见醋酸菌菌悬液对酿酒酵母的生长初期有一定的抑制，随着发酵的进行，酿酒酵母取代醋酸菌成为优势菌。发酵结束后，添加醋酸菌菌悬液对酿酒酵母乙醇产量没有影响，高产酯酿酒酵母都能发酵完全，残糖含量在4.1 g/L左右。

从图1可知，醋酸菌菌悬液与高产酯酿酒酵母共发酵，只有醋酸菌菌悬液接种量大时[20 mL(3×109CFU/mL)]对酿酒酵母乙酸乙酯的产量有所提高，乙酸乙酯最多增加12%，其他添加量下无显著差异(P>0.05)。随着醋酸菌菌悬液添加量的增加，乙酸异丁酯含量也逐渐升高，在醋酸菌菌悬液添加量达到20 mL时，乙酸异丁酯产量增加一倍。乙酸异戊酯含量在醋酸菌菌悬液添加量为20 mL时有明显增高，增加33.8%，醋酸菌菌悬液其他添加量下对乙酸异戊酯产量无显著差异(P>0.05)。醋酸菌菌悬液各添加量下对高产酯酿酒酵母高级醇代谢的影响不大。

2.2 醋酸菌发酵液对高产酯酿酒酵母酒精发酵及酯醇代谢的影响

由表3可知，发酵进行到12 h时，与培养基内醋酸质量浓度为0时相比，培养基内醋酸质量浓度为2、4、6、8 g/L时酵母菌数分别下降了20.00%、54.17%、73.33%、86.67%。发酵进行到24 h时，随着培养基内醋酸质量浓度升高酵母菌数都呈下降趋势，2、4、6、8 g/L下酵母数比对照低18.42%、21.05%、63.16%、81.57%。发酵到72 h,在醋酸质量浓度为2、4、6 g/L时，高产酯酿酒酵母MY-15乙醇产量与对照相比没有显著差异，残糖最多相差0.3 g/L。而当培养基内醋酸质量浓度为8 g/L时，乙醇产量仅为11.34 g/L，残糖为150 g/L，说明酿酒酵母的生长及代谢被严重抑制。

向高粱汁培养基内添加醋酸菌发酵液，配制不同醋酸浓度的培养基，探究培养基初始醋酸浓度对高产酯酿酒酵母酒精发酵及酯醇代谢的影响。由图2可知，当培养基醋酸质量浓度大于4 g/L时，乙酸乙酯就开始呈下降趋势，当醋酸质量浓度为4 g/L时，乙酸乙酯下降7.91%，醋酸质量浓度为6 g/L时，乙酸乙酯下降49.39%；当醋酸质量浓度为8 g/L时，乙酸乙酯下降88.26%。乙酸异丁酯和乙酸异戊酯都是随着培养基内醋酸质量浓度的增加而降低，在培养基内醋酸质量浓度为8 g/L时，乙酸异丁酯最多下降99.18%。酿酒酵母正丙醇产量在醋酸质量浓度为0、2、4、6 g/L时含量变化差异不显著，但在醋酸质量浓度为8 g/L时下降了92.99%。异丁醇在醋酸质量浓度为2、4、6、8 g/L时分别下降2.22%、11.22%、11.33%、75.28%。异戊醇、苯乙醇和活性戊醇都是随着醋酸质量浓度的增加而降低，在醋酸质量浓度为2、4、6、8 g/L时，异戊醇降低了18.55%、51.39%、71.05%、92.97%；苯乙醇降低了31.79%、76.02%、88.81%、97.93%；活性戊醇下降了51.62%、71.85%、79.12%、94.63%。

2.3 醋酸菌对高产酯酿酒酵母转录水平的影响

以上结果说明，醋酸菌的代谢产物对高产酯酿酒酵母的酯醇代谢影响较大，特别是在培养基醋酸质量浓度为6 g/L时，高产酯酿酒酵母能进行完全的酒精发酵，但是酯醇代谢被抑制，乙酸酯类下降60%，高级醇下降50%，所以我们选取醋酸质量浓度为6 g/L时为实验组(编号Ace)，以培养基内醋酸质量浓度为0 g/L为对照组(编号MY-15)，培养至对数期取样，将样品送至诺禾致源生物有限公司进行转录组测序。

经过数据质控，参考基因组对比，差异分析得到图3火山图，如图3所示，在培养基初始醋酸质量浓度为6 g/L时，高产酯酿酒酵母MY-15共有394个基因转录水平上调，282个基因转录水平下调。

GO数据库把基因的本体分为3种：生物过程(biological process,BP)，细胞组成(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)。由图4可知，高产酯酿酒酵母差异基因主要富集在BP过程中的氧化还原过程(GO：0055114)、跨膜运输(GO：0055085)；差异基因主要集中在细胞组成细胞壁(GO：0005618)、外部封装结构(GO：0030312)、细胞外围(GO：0071944)、膜(GO：0016020)、膜的组成成分(GO：0016021)、膜的固有成分(GO：0031224)、氧化还原酶活性(GO：0016491)和细胞壁结构成分(GO：0005199)；富集在分子功能上的主要是血红素结合(GO：0020037)和四吡咯结合(GO：0046906)。这也印证了醋酸主要通过影响细胞膜的生理功能进而影响微生物的生长及代谢[21]。

京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)是一个整合了基因组、化学和系统功能信息的数据库。从KEGG富集结果中，选取最显著的20个KEGG通路绘制成散点图并进行展示，如图5所示。图5中横坐标为注释到KEGG通路上的差异基因数与差异基因总数的比值，纵坐标为KEGG通路，点的大小代表注释到KEGG通路上的基因数，颜色从红到紫代表富集的显著性大小。

由图5可知，在培养基醋酸质量浓度为6 g/L时，高产酯酿酒酵母的多条代谢途径受到影响，这些代谢途径主要是抗生素的生物合成、次生代谢产物的生物合成、碳代谢、TCA循环、氨基酸生物合成、精氨酸的生物合成、糖酵解、氧化磷酸化、乙醛酸和二元酸代谢、硫胺酸代谢、2-氧羟基水杨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、丙酮酸代谢、类固醇生物合成、半胱氨酸与蛋氨酸代谢等。

编码醇乙酰基转移酶的ATF1和ATF2基因没有检测到转录水平的变化，而在醋酸质量浓度为6 g/L时高产酯酿酒酵母的乙酸酯明显下降，说明醋酸有可能使高产酯酿酒酵母醇乙酰基转移酶的活性降低。

高级醇分解代谢途径中密切相关的芳香族氨基酸转移酶ARO8、ARO9、ARO10基因和支链氨基酸转移酶BAT2基因没有检测到有转录水平的变化，而在醋酸质量浓度为6 g/L时高产酯酿酒酵母的高级醇明显下降，说明醋酸有可能使氨基酸转移酶的活性降低或者是高级醇分解代谢途径没有受到影响。推测酿酒酵母高级醇的合成代谢途径受到的影响比较大，所以结合高级醇的合成代谢途径来分析酿酒酵母高级醇降低的原因。苯乙醇的降低可能是因为醋酸影响了高产酯酿酒酵母的糖酵解过程，由糖酵解途径生成的苯丙酮酸产量减少，进而苯乙醇的产量下降。在正丙醇和活性戊醇这条代谢途径中，检测到ILV3基因表达上调2.42倍，这可能会使由α-酮丁酸产生的α-酮酸-β-甲基戊酸增多，那么相应的由α-酮丁酸合成正丙醇的产量就有所下降；由α-酮酸-β-甲基戊酸到活性戊醇这条途径中，关键基因有PDC1、PDC5、PDC6、ARO10和THI3，只有PDC6基因下调20.15倍，这有可能是活性戊醇下降的原因。由α-酮基异戊酸到异丁醇这条途径中关键基因主要有PDC1、PDC5、PDC6，所以PDC6表达明显下调，也可能是异丁醇下降的原因。在异戊醇这条代谢途径中，关键的基因有LEU1、LEU2、LEU4、LEU5、THI3，而这些基因都没有检测到转录水平的变化，但是异戊醇的产量下降明显，说明醋酸有可能使这些酶的酶活下降或者还有其他基因的表达水平的变化能影响到异戊醇的产量。

在培养基初始醋酸质量浓度为6 g/L时，与对照组相比，高产酯酿酒酵母变化倍数最大的基因是DAL80，下调了53.34倍，DAL80是多种氮降解途径的负调控基因，说明这个基因可能在高级醇调控中具有重要作用；其次变化大的基因为GAP1，下调了40.57倍，这个基因是通用型氨基酸通透酶，负责酵母氨基酸转运；脯氨酸通透酶PUT4下调了27.18倍，这也可能跟高级醇的降低有关系。

3 结论

保持高产酯酿酒酵母接种量不变，添加醋酸菌菌悬液在发酵前期对酿酒酵母的生长有所抑制，醋酸菌菌悬液添加量为20 mL时，酵母数比单独发酵下降了28%，乙酸乙酯增加了12%，醋酸菌菌悬液添加量下对酿酒酵母酒精发酵及高级醇代谢影响不大；但是培养基内醋酸质量浓度对酿酒酵母生长及代谢的影响很大，随着培养基内醋酸质量浓度的增加(0～6 g/L)，高产酯酿酒酵母的乙酸酯类和高级醇含量逐渐降低，但是高产酯酿酒酵母的酒精发酵正常，72 h后乙醇产量在74 g/L左右。当醋酸质量浓度为8 g/L时，高产酯酿酒酵母的酒精发酵及酯醇代谢被完全抑制，乙醇产量仅为11.34 g/L，乙酸酯和高级醇比对照组下降约90%。

转录组测序结果表明，当培养基内初始醋酸质量浓度为6 g/L时，与对照组相比，高产酯酿酒酵母MY-15共有394个基因转录水平上调，282个基因转录水平下调，这些差异基因主要富集在高产酯酿酒酵母细胞膜的组成，其中高产酯酿酒酵母的碳代谢、TCA循环、氨基酸生物合成、糖酵解、氧化磷酸化、硫胺酸代谢、丙酮酸代谢等多条代谢途径受到影响。

白酒生产是多菌种混合发酵，发酵过程中参与的微生物种类繁多，而且不同的微生物对酿酒酵母的影响各有不同，本实验研究了醋酸菌(巴氏醋杆菌)对酿酒酵母酒精发酵及酯醇代谢的表型差异与转录组差异，想要透彻了解相互作用机理，还需进一步从基因转录水平进行更深层次的研究。