四大产区商品莼菜多糖组成及抗氧化活性分析

李京凌，滕左，韩芳，袁婧，于杰,3*

1(西南大学 园艺园林学院，重庆,400715) 2(重庆市铜梁二中，重庆,402560) 3(南方山地园艺学教育部重点实验室，重庆,400715)

莼菜(BraseniaschreberiJ.F.Gmel.)是莼菜科(Cabombaceae)多年生水生宿根草本，在我国重庆、云南、四川、湖南、湖北、浙江和江苏等地均有分布[1]。莼菜含有丰富的微量元素、膳食纤维、多糖物质和多种人体必需氨基酸[2-4]，具有降血脂、抗氧化和调节免疫等功效[5-11]，应用前景广阔[12-13]。莼菜幼叶的果胶中富含多糖，莼菜多糖的单糖组成成分及生物活性一直是莼菜的研究热点。据KAKUTA等[14]、王倩[7]、张平等[15]分析研究，发现莼菜多糖含有半乳糖、岩藻糖、甘露糖等多种单糖成分，但具体单糖种类及含量在各报道中存在差异；周毅峰等[9]研究报道了莼菜多糖具有良好的抗氧化活性，但对抗氧化活性起作用的具体单糖物质目前仍缺乏系统的研究。

本研究采用苯酚-硫酸显色法对不同产区莼菜总糖含量进行测定，利用高效液相色谱法检测莼菜多糖成分及含量，采用DPPH、FRAP、ABTS法对莼菜多糖进行抗氧化活性测定，最后通过相关性分析探究对抗氧化活性有贡献的具体单糖物质，旨在为我国莼菜资源研究提供更多的基础数据，也为莼菜的生产加工及相关产品的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

本实验以重庆石柱(SZ)、湖北利川(LC)、四川雷波(LB)、浙江西湖(XH)4个地区莼菜的嫩叶为材料。

石油醚、氯仿、正丁醇、三氟乙酸、苯酚、过氧化氢等试剂,成都科龙化工试剂厂。单糖标准品,美国Sigma公司(St Louis，Mo，USA)。

1.2 仪器与设备

Scientz-10N冷冻干燥机，宁波新芝冻干设备股份有限公司；721G可见光分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；Agilent1200高效液相色谱仪，南京利尔实验仪器设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 莼菜多糖的提取

将各产区莼菜冷冻干燥，粉碎过40目筛获得莼菜干粉，参考周毅峰[9,16-17]方法提取莼菜多糖。离心所得上清液中的蛋白质用Sevag法[18]除去，最后所得碱溶性及水溶性多糖溶液置于4 ℃冰箱保存[6]。

1.3.2 总糖含量测定

参考宁可[19]方法绘制标准曲线测总糖含量。

1.3.3 HPLC测定多糖组成及含量

参考符梦凡等[20]、栾丽杰等[21]柱前衍生化HPLC法略加修改。色谱条件：选用Thermo C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，柱温25 ℃，流速为1.0 mL/min，进样量10 μL，流动相为0.1 mol/L pH 7.0V(磷酸盐缓冲溶液)∶V(乙腈)=82∶18的溶液，波长245 nm。

1.3.4 抗氧化能力测定

参考左龙亚[22]、张昭[23]的DPPH、ABTS和FRAP法检测样品的抗氧化能力。

1.3.5 统计学处理

实验进行3次生物学重复，采用SPSS 19.0软件进行单因素差异分析(one-way analysis of variance，ANOVA)及皮尔森相关性分析[24](pearson’s correlation analysis)，显著性水平为0.05。莼菜多糖类物质抗氧综合百分比(antioxidant percent comprehensine,APC)指数/%=(测定值/最大值)×100，APC综合指数/%=Σ[(测定值)/(3×最大值)×100]。

2 结果与分析

2.1 四大产区莼菜总糖含量分析

以葡萄糖为标准品，绘制所得标准曲线(y=0.046x-0.000 9，R2=0.999 9)如图1所示，在0～10 mg/mL范围内线性关系良好。利用该标准曲线对不同产区莼菜的总糖含量进行分析，结果如图2所示。

莼菜碱溶性及水溶性多糖含量在不同产区中均存在显著性差异(P<0.05)。雷波莼菜碱溶性多糖含量最高，达到(10.150±0.236)mg/g(Mean±ED，下同)；利川莼菜水溶性多糖含量最高，为(7.360±0.190)mg/g。除利川莼菜外，其他3个产区莼菜中的碱溶性多糖含量均高于水溶性多糖。

受采摘季节及取材部位等因素影响[19]，莼菜总糖含量在各研究报道中存在一定差异[16,19,25]。本研究所测总糖含量相较其他报道偏低，除莼菜嫩叶可能存在多糖物质合成积累不足外，还可能是莼菜中含有相同浓度下吸光值较葡萄糖低的单糖组分，故以葡萄糖为标准曲线计算所得总糖含量偏低。在本研究中，雷波莼菜的总糖含量最高，为(15.470±0.348)mg/g，显著高于含量最低的利川莼菜(14.500±0.179)mg/g(P<0.05)。莼菜多糖含量的地区差异除与生长状况有关外，还与品种及产区生态条件密切相关[3]。

2.2 四大产区莼菜多糖的组成及含量分析

2.2.1 HPLC结果分析

将10种单糖标准品在245 nm波长下进行检测，所得回归方程如表1所示，相关性良好。图形波峰明显，对称性良好，能够进行各类单糖物质的检测。图3为部分样品及标准品色谱图。

2.2.2 多糖的组成及含量分析

据余昌均[25]研究报道，莼菜多糖中各单糖组分及所占比例为：半乳糖32%～40%、葡萄糖醛酸19%～29%、岩藻糖13%～16%、甘露糖10%～14%、鼠李糖6%～9%、木糖2%～7%、阿拉伯糖2%～3%和少量葡萄糖，共8种单糖组分。与余昌均[25]报道相比，王倩[7]、宁可[19]研究报道为7种单糖组分，均未检测到葡萄糖醛酸，而崔杰等[26]同样报道为7种单糖组分，未检测到阿拉伯糖。

本研究以4大产区莼菜嫩叶为材料，分别测定莼菜碱溶性多糖和水溶性多糖的组分及含量，结果如表2所示。所测成分为半乳糖等10种单糖，各单糖在2类多糖中的含量存在差异。各产区莼菜的半乳糖质量分数在2类多糖中均为最高(36.05%～40.33%)，其次是岩藻糖(14.32%～16.68%)、甘露糖(11.60%～16.35%)和葡萄糖醛酸(6.85%～12.55%)，其他单糖组分为鼠李糖、木糖、阿拉伯糖，少量葡萄糖、半乳糖醛酸和核糖。其中，半乳糖醛酸和核糖均为首次报道，核糖可能因含量过低而在部分莼菜中未检测出。以往的报道中，一般均认为半乳糖在莼菜多糖组分中含量最高，但其余单糖组分及所占比例在各报道中不尽相同。除半乳糖外，王倩[7]研究报道，其次应为鼠李糖、岩藻糖和木糖，而崔杰等[26]报道为岩藻糖、木糖和鼠李糖。本研究所测结果显示半乳糖、岩藻糖、甘露糖和葡萄糖醛酸的含量位列前四，与余昌均[25]研究结果最为接近。莼菜不同部位提取的多糖中各单糖组分及含量存在明显差异[19]。本研究所测甘露糖含量相比王倩[7]、崔杰等[26]报道偏高，葡萄糖醛酸含量相比余昌均[25]报道偏低，这除了与莼菜取材部位有关外，还可能是受提取溶剂的影响。在本研究中由于碱液浸提过程会对莼菜嫩叶细胞壁造成一定破坏，导致浸提液中的多糖种类及含量与水解法存在差异。

注：不带*表示水溶性多糖，带*表示碱溶性多糖，下同；ND表示未检测出。

比较4大产区莼菜水溶性多糖中各单糖组分及含量，发现主要单糖组分中，甘露糖、岩藻糖在利川莼菜中含量最高，分别为16.35%、16.30%；半乳糖在石柱莼菜中含量最高(40.33%)，西湖莼菜中含量最低(36.38%)；葡萄糖醛酸在雷波莼菜中含量仅6.85%，远低于其他产区；其余含量较低的单糖组分如葡萄糖、半乳糖醛酸的含量也存在一定差异。同样比较不同产区莼菜碱溶性多糖中各单糖组分及含量，发现西湖莼菜中的半乳糖、甘露糖和葡萄糖醛酸含量均为4个产区中最低，而岩藻糖在雷波莼菜中含量最低，为14.44%。核糖在西湖莼菜中的含量则远高于其他产区。莼菜对栽培条件要求较高，气候、水质等环境条件对莼菜多糖物质的合成有较大影响[27]，这是各产区莼菜单糖含量产生差异的重要原因。

2.3 四大产区莼菜多糖抗氧化活性分析

2.3.1 莼菜多糖DPPH自由基清除能力比较

前人对于莼菜多糖抗氧化能力的研究主要集中在多糖类型和莼菜取材部位[9,19]，本研究分别提取4大产区莼菜的碱溶性多糖和水溶性多糖，比较不同产区莼菜2类多糖抗氧化能力的差异。如图4所示，4大产区莼菜碱溶性多糖对DPPH自由基清除能力由强到弱为：雷波莼菜、石柱莼菜、利川莼菜、西湖莼菜。雷波莼菜清除率最高，清除率达(24.563±0.950)%，显著高于其他3个产区(P<0.05)。四大产区莼菜水溶性多糖中，利川莼菜对DPPH自由基清除能力最强，清除率为(46.950±0.976)%；显著高于石柱莼菜和西湖莼菜(P<0.05)，后2者分别为(40.990±0.528)%、(39.640±0.597)%，而雷波莼菜清除率最低，为(36.570±0.888)%。总体来说，莼菜的两种类型多糖对DPPH自由基清除能力均存在地区间的差异，且水溶性多糖对DPPH自由基清除能力强于碱溶性多糖。

2.3.2 莼菜多糖FRAP抗氧化能力比较

由图5可知：4大产区莼菜的2种类型多糖对FRAP铁离子还原能力均存在显著性差异(P<0.05)。

在莼菜碱溶性多糖中，对FRAP铁离子抗氧化能力由强到弱依次为：雷波莼菜、石柱莼菜、西湖莼菜、利川莼菜，其FRAP还原值依次为(61.060±1.756)、(56.450±0.966)、(48.250±1.777)、(42.820±1.961)μmol/g。而在莼菜水溶性多糖中，对FRAP铁离子抗氧化能力强弱顺序为：利川莼菜>石柱莼菜>西湖莼菜>雷波莼菜；最高还原值(利川莼菜)与最低还原值(雷波莼菜)分别为(60.775±1.181)、(40.980±1.119)μmol/g。

2.3.3 莼菜多糖ABTS自由基清除能力比较

由图6可知：在莼菜碱溶性多糖中，雷波莼菜ABTS自由基清除能力最强，为(48.690±1.782)%，显著高于利川、石柱莼菜(P<0.05)，但与西湖莼菜差异不显著。在莼菜水溶性多糖中，利川莼菜水溶性多糖对ABTS自由基清除能力最强，为(57.240±2.242)%；其次是雷波莼菜，为(52.620±1.256)%；石柱和西湖莼菜最弱，但均高于45%。总体来说，莼菜水溶性多糖对ABTS自由基清除能力强于碱溶性多糖，且存在产区间的差异。据周毅峰等[9]研究报道，莼菜水溶性多糖抗氧化能力强于碱溶性多糖，总抗氧化能力与多糖浓度密切相关，受水溶性多糖含量的影响更大。本研究针对不同产区莼菜的2类自由基清除实验中，水溶性多糖抗氧化能力强于碱溶性多糖，这与周毅峰等[9]的研究结果基本一致。

2.3.4 四大产区莼菜多糖抗氧化活性综合评价

3种抗氧化检测方法所得不同莼菜及多糖类型的APC综合性指数如表3所示，各类莼菜多糖的APC综合性指数在51.88%～99.62%之间。在水溶性多糖中，综合抗氧化力由强到弱依次为：利川莼菜、石柱莼菜、西湖莼菜、雷波莼菜；其中利川莼菜的综合抗氧化能力最强，APC综合性指数为99.62%，对DPPH自由基清除能力(APC指数100%)、ABTS自由基清除能力(APC指数100%)及对FRAP铁离子还原能力(APC指数98.86%)均达到最大APC指数；雷波莼菜则最弱，APC综合性指数为79.38%。

在碱溶性多糖中，综合抗氧化能力强弱顺序为：雷波莼菜、石柱莼菜、西湖莼菜、利川莼菜，APC综合性指数分别为67.84%、61.73%、55.06%、51.88%。各产区莼菜2类多糖抗氧化能力强弱顺序与其多糖的含量排序大致相同，这表明莼菜多糖的抗氧化活性与其含量密切相关。

综合2种类型多糖抗氧化能力比较各产区商品莼菜的抗氧化活性，结果为利川莼菜>石柱莼菜>雷波莼菜>西湖莼菜，其APC综合指数均值分别为75.75%、74.58%、73.61%、69.98%。以上数据表明，莼菜2类多糖均具有良好的抗氧化活性，这与周毅峰[9]、XIAO等[28]研究结果一致。但各产区莼菜2类多糖抗氧化能力存在显著差异(P<0.05)，这种差异除与多糖含量有关外，可能还与其所含的有效作用因子有关。

2.4 莼菜多糖物质组分与抗氧化活性的相关性分析

进一步分析莼菜多糖及其物质组分与抗氧化活性之间的相关性，如表4、5所示。相关系数表明，莼菜2类多糖的浓度对DPPH自由基清除率、FRAP铁离子还原能力均具有极显著或显著促进作用，相关系数在0.642～0.933之间。

注：**代表在0.01水平上显著相关(双尾)；*代表在0.05水平上显著相关(双尾)；下同。

莼菜水溶性多糖中，甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、木糖和岩藻糖在内的5种单糖组分具有一定的抗氧化作用。其中，甘露糖、葡萄糖醛酸和岩藻糖对DPPH自由基清除和FRAP铁离子还原均具有极显著或显著促进作用，相关系数在0.625～0.976之间。半乳糖仅对FRAP铁离子还原能力有较大贡献。而仅甘露糖和木糖对ABTS自由基清除具有极显著促进作用。核糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖和阿拉伯糖5种单糖则在对DPPH自由基清除或FRAP铁离子还原能力方面显示出显著或极显著的负相关，表明水溶性多糖中的这几类单糖对抗氧化活性具有抑制作用。

莼菜碱溶性多糖中，甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖和木糖在内的4种单糖组分具有一定的抗氧化作用，这4类单糖对DPPH自由基清除或FRAP铁离子还原能力均具有极显著的促进作用，相关系数在0.723～0.937之间。而仅木糖对ABTS自由基清除具有显著促进作用。核糖、半乳糖醛酸、阿拉伯糖和岩藻糖在内的4种单糖在DPPH自由基清除及FRAP铁离子还原能力方面显示出显著或极显著的负相关，表明碱溶性多糖中这4类单糖对抗氧化活性具有抑制作用。

综上，在2类多糖中，对抗氧化能力有贡献的单糖种类除岩藻糖外均一致。岩藻糖在水溶性多糖中为极显著正相关，而在碱溶性多糖中为极显著负相关，它对抗氧化活性的作用机制还有待进一步研究。而在不同抗氧化测定方法中，起作用的单糖种类存在差异：ABTS法主要是甘露糖、木糖起作用，DPPH及FRAP法中甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖和木糖均有不同程度贡献。

相关性分析数据表明，莼菜多糖的抗氧化活性与其含量及组成密切相关。甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖和木糖对抗氧化能力有显著促进作用，是抗氧化活性的有效作用因子。而核糖、半乳糖醛酸和阿拉伯糖则与抗氧化能力呈显著负相关，它们与鼠李糖、葡萄糖均不是抗氧化活性的贡献者。西湖莼菜多糖综合抗氧化能力较低，可能与其所含的甘露糖、半乳糖等有效作用因子相较其他产区偏低有关。

3 结论

由于莼菜对生长环境的要求较高，目前我国仅少部分地区种植莼菜。国内4大产区莼菜由于生长的环境条件不同，导致产生品质上的差异。本研究以国内四大产区商品莼菜为研究对象，分析了其总糖含量、多糖组成及含量，并分别提取四大产区莼菜的碱溶性多糖和水溶性多糖，比较不同产区莼菜2类多糖抗氧化能力的差异，探究各单糖组分对抗氧化活性的贡献。与其他产区莼菜相比，利川莼菜多糖的综合抗氧化能力更强。另外，各产区莼菜中，2类多糖均具有良好的抗氧化活性，但水溶性多糖抗氧化能力强于碱溶性多糖；而甘露糖等多种单糖组分对抗氧化活性具有显著的贡献作用。此结果对莼菜产区生态环境和栽培条件的研究有一定参考价值，同时，也为我国莼菜研究和莼菜多糖相关产品的开发利用提供理论依据。