黑曲霉低聚葡萄糖氧化酶的分子克隆与生化特征

苑馨瑶,田康明,金鹏,程磊,王正祥*

1(天津科技大学 化工与材料学院,天津,300457) 2(天津科技大学 生物工程学院,天津,300457)

低聚葡萄糖氧化酶(gluco-oligosaccharide oxidase，EC1.1.99.B3，Goox)是碳水化合物氧化酶的一种，作用于以α/β-1,4-糖苷键连接的低聚葡萄糖，催化氧化还原性末端残基生成相应的糖酸或内酯[1-3]。寡糖酸具有修复、抗氧化、保湿、促进机体更新等多重功效[4-5]，已应用于食品、化妆品、建筑、医疗、保健等诸多领域[6-7]。现有的乳糖酸、麦芽糖酸和纤维二糖酸多采用化学法制备，其工艺复杂、生产成本高且副产物影响较大[8-9]。Goox的发现使酶法制备寡醛糖酸成为可能。此外，Goox作为食品添加剂应用于纤维含量高的面团中，提高面团的筋度；还可以作为添加剂加入到饲料中，促进双歧杆菌的增殖，增加肠道对矿物质的吸收[10]；向酶中引入木聚糖底物结合区，可以用来检测和量化不同低聚糖，也可应用于低聚糖生物传感仪的构建[11-12]；因此，Goox还可应用于食品、饲料、化工等多个行业，应用潜力巨大。

1991年，LIN等首次在Sarocladiumstrictum中发现Goox，随后，KIRYU在Paraconiothyriumsp.中也成功分离得到该酶[13-14]。近几年对该酶的研究主要集中于异源表达、蛋白结构和应用领域方面。2005年，HUANG将来源于S.strictumT1中goox-T1基因在毕赤酵母中实现异源表达，通过对其蛋白结构进行分析，确认该酶的活性位点和催化机制[15]；2008年，KIRYU对来源于Paraconiothyriumsp.的Goox在乳糖酸转化方面的应用潜力进行研究，结果表明该酶可以有效地将乳糖转化为乳糖酸，转化率为100%[13]；2011年，MARYAM通过定点突变将来源于S.strictumCBS 346.7的goox-VN基因在毕赤酵母中实现了异源表达，通过定点突变提高了底物特异性[16]。但目前各项研究也仅围绕着2个来源的Goox进行，需要进一步研究获得不同来源的新酶。

本文通过生物信息学分析，从黑曲霉基因组中寻找到一疑似Goox的开放读框，进一步通过分子克隆技术对其进行克隆表达，并对其酶学性质和生化特征进行分析，为后续应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌种与质粒

黑曲霉(Aspergillusniger)F0215、大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109、毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115和质粒pPIC9K，皆为本实验室保藏；黑曲霉和大肠杆菌分别采用PDA和LB培养基进行培养。毕赤酵母及其重组菌按照实验室标准方法进行培养。

1.2 主要试剂

限制性内切酶XbaI、NcoI、SalI以及PyrobestTMDNA聚合酶和T4DNA连接酶，宝生物工程(大连)有限公司；质粒快速提取试剂盒、DNA纯化回收盒，北京庄盟国际生物基因科技有限公司；cDNA合成试剂盒，Roche公司；辣根过氧化物酶、麦芽三糖、麦芽四糖和麦芽五糖，北京索莱宝科技有限公司；苯酚、4-氨基安替比林，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；葡萄糖、半乳糖、木糖、乳糖、蔗糖、纤维二糖、麦芽糖和过氧化氢，国药集团化学试剂有限公司。

1.3 基因克隆与重组菌构建

1.4 重组酶的制备与纯化

参考毕赤酵母表达操作手册对上述重组菌进行发酵，8 000 r/min离心15 min,收集上清液，于-20 ℃保存。发酵上清液经饱和浓度为20%～80% (NH4)2SO4分级盐析后，再以HiTrap Desalting PD-10脱盐柱和Sephadex-100凝胶过滤层析柱进行纯化。

1.5 重组低聚葡萄糖氧化酶活力测定

酶活测定参照LEE等的方法[18]进行。1 mL反应体系包括：稀释酶液0.2 mL，0.1 mmol/L 4-氨基安替比林，1 mmol/L苯酚，1 mmol/L乳糖，0.05 U辣根过氧化物酶，0.1 mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH 9.0)。55 ℃水浴中反应30 min，冰浴5 min终止反应，测定500 nm下吸光度。以不加底物的反应体系作为空白对照组。酶活定义：每分钟氧化底物生成1 μmol过氧化氢的酶量为1个酶活力单位，以U/mL表示。

1.6 重组酶酶学性质与特征分析

1.6.1 最适温度的测定

在不同温度(40、45、50、55、60、65、70、75、80和85 ℃)下测定其酶活力，以最高酶活力为100%计算相对酶活，考察温度对重组酶活力的影响。

1.6.2 温度稳定性的测定

将酶液分别置于55、65、75、85和95 ℃下保温4 h，间隔1 h取样，按照1.5方法测定残余酶活，以最高酶活力为100%，计算相对酶活。

1.6.3 最适pH的测定

分别以0.1 mol/L磷酸-柠檬酸(pH 5.0～8.0)和碳酸钠-碳酸氢钠(pH 9.0～10.0)替换1.5方法中的缓冲液，测定不同pH条件下的酶活力，以最高的酶活力计为100%，计算相对酶活，考察pH值对酶活的影响。

1.6.4 pH稳定性的测定

将酶分别置于不同pH(5.0～10.0)的缓冲液中(终浓度一致)，室温放置4 h，间隔1 h取样，测定残余酶活。以最高酶活力为100%，计算相对酶活。

1.6.5 金属离子对酶的影响

在反应体系中分别加入终浓度为1 mmol/L的Ca2+、Zn2+、Mg2+、Fe3+、Ba2+、Co2+、Cu2+、Na+、Mn2+和K+，测定其酶活力，以未加金属离子的酶活力为100%，计算相对酶活。

1.6.6 动力学参数的测定

以不同浓度(1、5、10、15、20 mmol/L)的乳糖为底物，在重组酶的最适作用温度和pH条件下进行反应，测定酶活。采用双倒数法(Lineweaver-Burk)作图，计算米氏常数Km及最大反应速度Vmax。

1.6.7 底物特异性分析

分别以终浓度1 mmol/L的葡萄糖、木糖、半乳糖、乳糖、纤维二糖、蔗糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖和麦芽五糖为反应底物，测定酶活。以最适底物的酶活力为100%，计算其他底物的相对酶活。

1.7 生物信息学分析

从NCBI数据库中获得不同来源的Goox氨基酸序列，利用软件Clustal X2和Bioedit 7.0.9对这些序列进行多序列比对，并通过MEGA 4.0邻近法构建Goox进化树，分析它们亲缘关系的远近。

2 结果与讨论

2.1 黑曲霉基因组中存在疑似goox基因读框

根据现有报道的Goox序列Goox-vn和Goox-T1，利用NCBI数据库，对黑曲霉基因组序列进行分析发现，黑曲霉基因组中存在一个疑似goox的开放读框，进一步对来源于黑曲霉的Goox(命名为AnGoox)和Goox-vn、Goox-T1进行序列比对，结果如图1所示。

AnGoox与Goox-vn和Goox-T1的相似度分别为28.98%和28.71%。在它们的氨基酸序列中，都包含2个较为保守的结构域，一段位置在37～174之间，长度为137的FAD结合域，其起始基序为(PAAI)。另一段在结尾处长度约为44的黄素结构域。通过氨基酸序列比对，可知与FAD进行双共价连接的关键氨基酸残基为His80和Cys141。参与反应的关键氨基酸残基为Asp377和Try428，2个氨基酸引发底物的氢离子的转移，从而降低FAD辅因子能量。

2.2 黑曲霉Goox基因的克隆

以黑曲霉F0215的cDNA为模板对Goox基因进行PCR扩增，PCR产物经纯化和限制性内切酶XbaI酶切后，与经SnaBI和AvrII酶切的pPIC9K载体连接，通过NcoI酶切，验证了重组质粒的正确性，获得重组质粒pPIC-goox。经序列测定与分析发现，goox编码的氨基酸序列与黑曲霉CBS513.88基因组相应序列有2个碱基的差异，在1310和1410位上，F0215来源的碱基为G和A，参照菌株CBS513.88为A和C，导致2个氨基酸不同(G437E和Q467P)，但其对酶催化活性中心(H80、C141、D377、Y428)无影响(数据未呈现)。

利用MEGA 4.0将不同来源的Goox的氨基酸序列进行比对并构建进化树(图2)，此进化树反映了不同来源的Goox之间的遗传距离，AnGoox与其他来源的Goox相似度为28.91%～97.46%，其中，AnGoox与已报道的Goox-T1分属于不同分支，进一步分析发现，AnGoox的氨基酸与A.piperis中的Goox的相似度为97.46%。

2.3 重组Goox的表达与纯化

pPIC-goox重组质粒经SalI进行线性化转化毕赤酵母GS115中，通过G418抗性平板筛选高拷贝。获得重组菌GS115(pPIC-goox)。在250 mL摇瓶发酵120 h后，检测发酵液上清酶活，其Goox活力最高为5 mU/mL，因此确认该酶为Goox。

经硫酸铵沉淀和Sephadex-100凝胶色谱纯化后，比酶活为0.33 U/mL，纯化倍数和回收率分别为16.5和34.7%。进一步经SDS-PAGE分析，蛋白大小约为61 kDa(数据未呈现)，略高于理论值，分析可能存在N-糖基化[16]。

2.4 AnGoox酶学性质分析

2.4.1 最适温度和温度稳定性

温度对AnGoox的活力和稳定性的影响见图3。AnGoox的最适作用温度为75 ℃，在70～80 ℃范围内，其相对酶活在75%以上(图3-a)；在85 ℃保温4 h，剩余酶活力在70%以上，在95 ℃保温4 h，剩余酶活降至约30%(图3-b)。目前已报道的Goox的最适反应温度在37～55 ℃之间，S.strictum和Paraconiothyriumsp.来源的Goox在20～50 ℃条件下分别孵育1 h和24 h后，酶活维持在100%，但高于50 ℃酶活力迅速降低，S.strictum的Goox在60 ℃孵育1 h后，残余酶活仅剩15%，Paraconiothyriumsp.的Goox在60 ℃孵育24 h后，残余酶活仅为45%[13-14,16]。可见，AnGoox的最适反应温度及热稳定性均显著高于已报道的同类酶。

2.4.2 最适pH和pH稳定性

pH对AnGoox的活力和稳定性的影响见图4。AnGoox在pH 9.0下表现出最高的酶活力，pH改变则酶活迅速下降，在pH 7.0和pH 10.0下，酶活均降至约40%(图4-a)。在pH 5.0～9.0保温4 h后，剩余酶活在70%以上，显示出较好的pH耐受能力(图4-b)。AnGoox的最适pH与pH稳定性均与来源于S.strictum的Goox(最适pH=10.0，在pH为5～11条件下，孵育1 h酶活维持在100%)相似[13-14]。

2.4.3 不同金属离子对酶活的影响

如表1所示，多种金属离子均对AnGoox表现出激活或者抑制作用，1 mmol/L 的Mn2+对酶活有较为明显的促进作用，而相同浓度的Fe3+、Ca2+和Ba2+对酶活的抑制作用最为强烈。与来源于S.strictum的低聚葡萄糖氧化酶相比，Zn2+对S.strictum的Goox具有促进作用，而对AnGoox具有抑制作用[14]。

2.4.4 动力学参数

以不同浓度(1、5、10、15、20 mmol/L)的乳糖为底物，在最适温度和pH条件下测定酶活，采用双倒数法，绘制AnGoox的动力学曲线，如图5所示，求得AnGoox的Km值为0.48 mmol/L，Vmax为2.22 μmol/(L·min)。该酶的Km高于Paraconiothyriumsp.的Goox(0.11 mmol/L)[13]和S.strictum的Goox(0.066 mmol/L)[18]，说明AnGoox对乳糖底物的亲和力低于前期报道的2种酶。

2.4.5 底物特异性研究

分别以10种不同的糖作为底物，研究AnGoox特异性，结果如图6。在10种底物中，AnGoox的氧化能力从高到低依次为麦芽四糖、麦芽三糖、麦芽五糖、乳糖、纤维二糖、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、木糖、半乳糖。该酶与S.strictum的Goox底物特异性相似，都具有对单糖、双糖和麦芽低聚糖的氧化能力[16,18]。AnGoox对麦芽低聚糖氧化能力优于来自S.strictum的Goox，显示该酶为酶法制备低聚糖酸提供新的可能。

3 结论

本研究首次鉴定了黑曲霉来源的低聚葡萄糖氧化酶，并成功在毕赤酵母中异源表达，系统的酶学性质解析为其后续应用研究提供了基础材料。