线粒体功能障碍在心肌缺血再灌注损伤发病中的作用及靶向治疗研究进展

童英，段小花，杨丽萍，张光云，陈普

云南中医药大学/云南省傣医药与彝医药重点实验室，昆明650500

急性心肌梗死是一种由心肌缺血造成的心脏病，临床上常采用再灌注治疗来改善梗死区的血液循环，但也往往导致心肌缺血再灌注损伤(MIRI)，严重威胁心肌梗死患者的生存和预后。MIRI发生的始发环节普遍认为是三磷酸腺苷(ATP)缺乏，而ATP由线粒体通过三羧酸循环(也称柠檬酸循环、Krebs循环)和氧化磷酸化来合成，且线粒体提供了维持心肌细胞正常生理功能所需的95%的能量，这就凸显出线粒体在心肌细胞中的地位，只有维持其结构和功能的完备性，心肌细胞才能进行正常的生理活动。因此，线粒体是心肌细胞命运的决定性因素，其损伤是MIRI的关键环节。现就线粒体功能障碍在MIRI发病中的作用及靶向治疗研究进展综述如下，以期为MIRI发病机制和临床治疗提供参考。

1 线粒体的功能

线粒体是存在于真核生物中具有脂质双分子层膜结构的细胞器，从外到内分别为外膜、膜间隙、内膜和基质。线粒体外膜平滑、通透性较高，可介导多种蛋白运输；内膜向内凹陷形成嵴，线粒体的表面积增加，从而为膜依赖型的反应(例如氧化磷酸化)提供了较大的面积，呼吸链蛋白、分裂与融合蛋白均在此；膜间隙中含有线粒体通透性转换孔(mPTP)，其开闭状态与线粒体功能是否正常有关。线粒体的主要功能有：①合成ATP。线粒体既是细胞的“能量工厂”，也是ATP合成的主要场所，为细胞生长和增殖提供95%能量来源[1]。②维持Ca2+稳态。线粒体Ca2+的吸收、储存及释放通过内膜中电化学质子梯度来调节，维持着细胞内Ca2+稳态，同时Ca2+还介导线粒体内多种酶，因此，Ca2+浓度会影响线粒体能量代谢。③产生活性氧(ROS)。ROS主要产生于线粒体内，是线粒体合成ATP过程中的副产物，在氧化应激和细胞调亡中起着重要作用。④调控细胞凋亡。线粒体是细胞凋亡的调控中心。线粒体受损时，会释放细胞色素c(Cyt c)、Caspase-3等凋亡相关因子，激活细胞凋亡程序，进而促进细胞死亡。⑤介导线粒体自噬。线粒体可通过自噬选择性地识别和清除受损的线粒体[2]，线粒体自噬避免受损线粒体对邻近线粒体和细胞造成损害，有助于对线粒体的质量控制及维持线粒体的正常功能。⑥调节mPTP开合。mPTP一般只在病理条件下开放。当线粒体受损或Ca2+超载时mPTP则会开放，从而造成细胞凋亡和细胞坏死。

1.1 合成ATP 第一阶段：糖酵解(以一分子葡萄糖举例，下同)。糖酵解在胞质中进行，即一分子葡萄糖在厌氧条件下转化为二分子丙酮酸，并产生2 ATP和2[NADH+H+](还原型辅酶Ⅰ)。第二阶段：三羧酸循环。糖酵解产生的二分子丙酮酸在线粒体基质上继续氧化脱羧形成二分子乙酰辅酶A，其中一分子乙酰辅酶A和一分子草酰乙酸反应合成一分子柠檬酸，经过三羧酸循环，再生成一分子草酰乙酸与剩下一分子乙酰辅酶A反应，开始又一次循环，共产生2 ATP、8 [NADH+H+]和2 FADH2(还原型黄素二核苷酸)，这一过程不需要O2参与。第三阶段：氧化磷酸化。这一阶段在线粒体内膜进行，需要O2参与。线粒体呼吸链(ETC)定义为在生物氧化过程中，通过一系列的递氢反应和递电子反应，成对氢原子从代谢物上脱下来，按固定顺序传递给氧生成水，并伴随能量生成的过程。ETC的作用代表线粒体最基本的功能。ETC涉及多个亚基复合物，包括复合物Ⅰ、复合物Ⅱ、复合物Ⅲ和复合物Ⅳ，即NADH脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、CoQ-细胞色素c还原酶、细胞色素c氧化酶，以及移动电子载体泛醌(CoQ)和Cyt c。NADH和FADH2分别提供电子给复合物Ⅰ和Ⅱ，然后转移至CoQ，电子通过CoQ被引导至复合物Ⅲ，然后Cyt c转移电子至复合物Ⅳ，最后将电子转移到1/2 O2[3]。呼吸链中质子跨膜转运使得大量的质子从基质转运到膜间隙，造成内膜外侧质子浓度高于内膜内测，从而建立了质子梯度并形成了电化学梯度，即pH梯度和跨膜电势差，随后，质子顺梯度跨膜内流，经复合物V(ATP合酶)作用，最终生成H2O和CO2等终末产物，并伴随能量释放，二磷酸腺苷(ADP)被磷酸化生成ATP。至此，完成氧化磷酸化的全过程，这就是米歇尔于1961年提出的化学渗透理论[4]。合成的ATP可用于生物过程，例如肌肉收缩、神经冲动传导、类固醇和血红素的生物合成、钙和铁稳态、程序性细胞死亡等。

1.2 维持Ca2+稳态 不同刺激(例如营养素、激素、神经递质等)有着不一样的能量需求，从而产生相对应的Ca2+浓度，进而刺激能量产生以维持各自的能量需求[5]。Ca2+不会单独流过细胞膜和线粒体膜，它的转运主要依赖于Na+，并且维持Ca2+稳态的主要调节剂是Na+/Ca2+交换剂(NCX)。NCX催化跨质膜的3个Na+和1个Ca2+离子的双向流变交换，即以Ca2+外流/Na+流入模式(正向模式)或Ca2+内流/Na+流出模式(反向模式)运行[6]。线粒体Ca2+的浓度与其能量代谢、膜的通透性、细胞存活和死亡等密切相关[7]。

1.3 产生ROS ROS主要来源于线粒体，包括自由基和过氧化氢。ROS产生的主要位点是呼吸链复合物Ⅰ，它包含ROS的两个生化因子：黄素单核苷酸位点(IF位)和泛醌结合位点(IQ位)。除呼吸链复合物外，mPTP的开放也会释放ROS，并累积潜在毒性的ROS，在较高的ROS水平下，mPTP又会大幅增加ROS的释放，这种现象称为“ROS诱导的ROS释放”(RIRR)[8]。过量的ROS会导致许多病理过程，包括衰老、细胞凋亡[9]、脂质膜、蛋白质以及核酸受损。

1.4 调控细胞凋亡 细胞凋亡是一种受基因调控，具有自我破坏性的程序性细胞死亡，是一种主动性死亡过程，与被动死亡的坏死是两种基本不同的死亡形式，其中调控细胞凋亡的核心是Caspase半胱氨酸蛋白酶家族，Caspase-3是其主要执行者，被称为“死亡蛋白酶”[10]。当线粒体释放Cyt c到胞浆中后，在三磷酸脱氧腺苷(dATP)和ATP存在条件下与凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf1)相互作用，聚合形成凋亡小体，导致上游因子Caspase-9活化，然后，通过级联反应激活Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7等下游因子，使凋亡不可避免，最终导致细胞死亡[11]。同时，Bcl-2家族也是一种常见的凋亡控制基因[12]，Bcl-2家族中主要包括：抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax、Bak。Bax和Bcl-2两者之间具有拮抗作用，即当Bcl-2的表达下降时，Bax和Bak表达反而上升，此时细胞凋亡加速；当Bcl-2表达升高时，Bax和Bak表达反而会降低，此时细胞凋亡受到抑制。mPTP也参与到细胞凋亡过程中，当其开放延长时，Bax和Bak使膜通透性增加，诱导线粒体碎裂和Cyt c释放，激活级联反应，并导致细胞凋亡[13～15]。

1.5 介导线粒体自噬 线粒体自噬是一种受各种因子调节的识别和清除功能紊乱线粒体的过程，主要通过Pink1/Parkin介导[16，17]。蛋白激酶Pink1提示受损的线粒体中膜电位的丧失，该蛋白具有线粒体靶向序列，正常条件下会在线粒体内部保持降解状态，但是当线粒体膜电位降至一定水平以下时，Pink1无法从线粒体外膜转入线粒体内部，降解停止。之后，Pink1在外膜积累，在这里它从细胞质中补充E3泛素连接酶Parkin，进而通过泛素化和降解线粒体外膜蛋白Miro来触发线粒体自噬[18]。此外，线粒体自噬还存在Bnip3、FUNDC1等通路[19]。自噬是一个质量控制的过程，是维持一个健康的线粒体网络所必需的，这一过程还与线粒体分裂和融合有关，它们之间的平衡维持着线粒体正常功能[20，21]。

1.6 调节mPTP开合 线粒体膜的通透性靠mPTP的开启和关闭来调节。mPTP是位于线粒体膜间隙的非特异性高导电性通道，是一种多蛋白复合物，维持内外离子的相对稳定性，对保持稳定的电势差和膜电位起着至关重要的作用[22]。生理情况下mPTP是处于关闭状态，它控制线粒体氧化磷酸化来调节能量代谢。mPTP的开放使得小于1.5 kDa的分子非选择性渗透进入线粒体内膜，从而破坏了线粒体膜电位，与氧化磷酸化解偶联并导致ATP缺乏和细胞死亡。mPTP的另一个重要作用是使线粒体膜通透性增加，使线粒体肿胀，并释放促凋亡因子，激活细胞凋亡程序，最终导致细胞死亡[23]。

2 线粒体功能障碍及其在MIRI发病中的作用

心肌细胞里富含大量的线粒体，心脏维持正常的生理功能需要消耗大量能量，而能量的供给依赖于心肌细胞中的线粒体，因此，只有保持线粒体结构和功能的完整性才能保证心肌细胞的正常生理功能。心肌缺血时，线粒体受到损伤，再灌注期间，线粒体结构和功能遭到进一步破坏，使存活的心肌细胞继续减少，出现MIRI。MIRI出现的原因可能如下：ATP合成减少，能量不足，心脏就无法维持正常生理功能，坏死面积进一步加大；mPTP开放会加重Ca2+和ROS的积累，并且Ca2+和ROS的超负荷可加剧线粒体损伤，放大线粒体功能障碍并导致能量代谢紊乱；凋亡信号通路的激活和线粒体过度自噬会致使大量正常的心肌细胞死亡。线粒体功能的这种降低会触发恶性循环，影响再灌注的治疗效率。

2.1 ETC受损和能量代谢障碍在MIRI发病中的作用 MIRI发生的始发环节普遍认为是能量代谢障碍。当心肌细胞处于缺血状态时，心肌能量代谢中大部分有氧氧化转变为糖酵解途径，其产生的少量ATP逐渐成为维持心肌细胞生命活动的唯一能量来源[24]，糖酵解使细胞内的乳酸水平增加，细胞进而发生代谢性酸中毒，而酸中毒又会抑制糖酵解，加重能量供应不足。再灌注过程中，对糖酵解的抑制作用会减弱，酸中毒加深。同时，大量的线粒体受损，ETC受损，使即使恢复了有氧再灌注，线粒体也不能有效地进行有氧氧化产能，导致恢复再灌注的相当一段时间内糖酵解仍然是主要产能途径，但糖酵解产生的ATP远远不够满足心肌细胞的正常需求，导致心肌细胞的损伤甚至凋亡[25]。

2.2 线粒体Ca2+超载在MIRI发病中的作用 心肌缺血时，体内主要产能途径变成糖酵解途径，乳酸水平增加引起细胞酸中毒，pH值下降(<7.0)。再灌注期间，细胞外pH值迅速恢复，并在细胞内外形成一个跨膜pH梯度，激活了Na+/H+交换蛋白(NHE)，H+转运出细胞，细胞内Na+大量增加。同时，糖酵解产生的ATP远远不够满足心肌细胞的正常需求，Na+-K+-ATP酶活性受到抑制，Na+不能及时从细胞内排出，导致细胞内Na+超载，从而激活Na+/Ca2+交换机制的反向模式，大量Ca2+内流，最终导致Ca2+超载。此外，缺血再灌注时ATP生成不足和线粒体膜电位恢复分别导致细胞膜上Ca2+-ATP酶(Ca2+泵)活性降低和线粒体钙单向转运蛋白(MCU)的激活，加重了细胞内Ca2+超载[26]，从而加剧线粒体损伤，最终导致心肌细胞死亡。

2.3 线粒体ROS增多和细胞凋亡在MIRI发病中的作用 线粒体不仅是细胞内ROS的主要来源，也是细胞凋亡的调控中心。在心肌缺血再灌注初始几分钟，ROS会爆发性增加，引起氧化应激和脂质过氧化反应，而不正常的氧化应激会导致ETC受损所致的ROS绝对增加以及抗氧化酶活性降低所致的ROS相对增多，造成恶性循环。此时，线粒体既无法为机体提供充足能量，产生的ROS还会进一步损伤线粒体，造成心肌细胞氧化损伤、mPTP持续开放，释放Cyt c，进而活化Caspase-3等下游因子，细胞凋亡程序被激活，细胞裂解，最终被吞噬。

2.4 线粒体自噬在MIRI发病中的作用 线粒体自噬是一种受各种因子调节的识别和清除功能紊乱线粒体的过程，是一个质量控制的过程，用以保持线粒体功能的完整性。正常条件下，机体通过启动线粒体自噬来清除受损的心肌细胞，以保护邻近正常的心肌组织。但是，过度的线粒体自噬会将正常的线粒体降解并加剧对心肌细胞的损害[27]。再灌注发生时，ROS大量产生和Ca2+超载等会造成线粒体损伤，进而过度激活自噬，引起大量不必要心肌细胞进一步损伤。

2.5 线粒体mPTP开放在MIRI发病中的作用 mPTP的不可逆开放是MIRI发展的最后阶段[28]，它在心肌细胞死亡中起着关键作用。mPTP在急性心肌缺血期间保持关闭状态，仅在再灌注的前几分钟内开放，膜通透性增加，允许通常无法跨过内膜的小分子非选择性通过，从而进一步增加了线粒体基质中的渗透压，导致更多的小分子物质进入线粒体内膜，形成恶性循环，促使线粒体肿胀甚至破裂，线粒体功能出现障碍，同时，Bcl-2家族成员中促凋亡蛋白Bax和Bak诱导Cyt c等因子向胞浆释放，通过一系列级联反应激活调亡程序，导致细胞调亡[25，29]。Ca2+超载、ROS暴增、pH值变化等均会导致mPTP开放[30]，这些因素通过激活mPTP的重要组分亲环素D(Cyp D)，延长mPTP开放时间，使电化学质子梯度溃散，与氧化磷酸化解偶联，ATP合成停止，随之发生细胞坏死。另一方面，mPTP开放导致的受损线粒体成为线粒体自噬的标记，通过Pink1/Parkin途径使正常心肌细胞死亡。因此，线粒体功能障碍引起的不良反应之间相互交叉重叠，最终会导致mPTP的过度开放，加重MIRI的程度或进程。

3 MIRI患者线粒体功能障碍的靶向治疗

MIRI防治有缺血预适应、缺血后处理、远程缺血预适应、药理性预适应、药物后处理等方法，但在临床上疗效不佳，随着医学的进步，研究者发现线粒体功能障碍是MIRI发生的主要因素，线粒体是MIRI心肌保护中一个有吸引力的靶点,于是线粒体靶向治疗MIRI逐渐开始从基础走向临床。线粒体靶向治疗是指药物针对受损线粒体特定部位的一种治疗方法，具有抵消线粒体功能障碍引起的不良事件的作用。急性心肌缺血时，多种因素引起线粒体受损，再灌注治疗后，线粒体功能进一步遭到破坏，并由此引发了MIRI。所以，通过线粒体靶向治疗，给予靶向药物，抑制线粒体功能障碍引起的不良事件，使其从病理状态恢复正常，减轻线粒体损伤，从而改善心肌细胞活力和减轻MIRI，加强心肌梗死的治愈率，具有极大的临床意义和研究价值。

3.1 靶向线粒体ATP通道药物 尼克地尔是线粒体KATP通道敏感性开放剂，它通过激活KATP通道，使大量K+进入线粒体，激活ETC，ATP合成增加的同时抑制ATP消耗，并保存ATP，减少心肌梗死的范围。同时，尼克地尔还可以降低Ca2+超载、抑制ROS爆发，保护MIRI[31]。二氮嗪是线粒体KATP通道特异性开放剂，也可使大量K+内流，线粒体基质容积增加，使ATP合成增加，减轻Ca2+超载以及使ROS合成减少，最终达到保护细胞保护作用[32]。

3.2 靶向线粒体F1F0ATP水解酶药物 MIRI期间，线粒体F1F0ATP水解酶含量上升，导致线粒体内大量ATP被无用消耗，而通过使用线粒体F1F0ATP水解酶抑制剂—BMS-199264，达到抑制ATP减少的作用。在体外实验表明，BMS-199264具有明显的大鼠心肌细胞保护作用，具有较好的研究前景[33]。

3.3 靶向线粒体Ca2+药物 MCU是一种位于线粒体内膜的蛋白质，负责线粒体Ca2+的吸收，MCU抑制剂可以降低MCU的表达，使线粒体Ca2+含量降低，致使Ca2+依赖的细胞凋亡减弱[34]。已普遍使用MCU抑制剂有RuR和Ru360[35]。NCX反向转运抑制剂和NHE抑制剂也对降低Ca2+超载有着良好效果。雷帕霉素通过激活NCX的正向模式，降低Ca2+浓度，抵抗MIRI。NHE抑制剂KR-32570、HOE694等则通过抑制Na+在细胞内的积累，从而激活NCX的正向模式，降低Ca2+浓度，从而发挥心脏保护效应[26]。

3.4 靶向线粒体ROS药物 线粒体是ROS的主要靶向位点，因此，清除ROS有助于减少心肌细胞死亡数目。目前，最具有研究意义的线粒体靶向抗氧化剂药物为以三苯基膦(TPP)为基础的线粒体抗氧化递送系统，如Vit E、泛醌等。TPP是一种亲脂性阳离子，抗氧化剂与TPP的共价键结合后，被线粒体迅速吸收，使抗氧化剂在线粒体内大量积累。Vit E抑制线粒体过氧化氢生成，减轻线粒体的氧化损伤；泛醌进入线粒体基质后，被迅速降解为抗氧剂泛醇，减少ROS的积累，抑制脂质过氧化反应[36]。此外，临床也常用SS家族的肽递送系统来递送药物至细胞的适当区域，以防止药物在血液循环中被清除。白藜芦醇(RSV)是一种强有力的活性氧清除剂，与SS肽结合，同时因SS肽与线粒体穿透肽的强结合亲和力，进入线粒体内，及时清除多余的ROS，使其含量保持在正常水平[37]。

3.5 靶向mPTP药物 mPTP特异性抑制剂通过抑制mPTP的持续性开放，维持线粒体的完整性，以改善MIRI。Cyp D为核基因肽基脯氨酰异构酶F(PPIF)编码的大分子蛋白，是mPTP的关键组分和正调节剂。因此，mPTP抑制剂主要是Cyp D抑制剂，包括大部分的靶向抑制Cyp D的抑制剂和少数的Cyp D非依赖性抑制剂。环孢菌素A(CsA)是一种免疫抑制剂，通过结合高度保守的脯氨酰异构酶的凹槽，靶向抑制Cyp D，使其位点失去活性来抑制mPTP的开放。Cyp D非依赖性抑制剂有肉桂酸和异恶唑等[38，39]。

总之，诸多研究证明线粒体功能障碍与MIRI密切相关，线粒体结构和功能正常与否关乎心肌细胞是否能正常进行生命活动，因此，对线粒体的相关研究成为MIRI的研究热点。同时，线粒体靶向治疗成为MIRI治疗的发展方向，通过抑制相关通路改善线粒体功能障碍来减轻MIRI，为MIRI提供了研究方向。