过表达c-SKI对心肌纤维化小鼠的心肌重构、心肌纤维化改善作用及其机制

王娟，向燕，韩素霞

1 新疆医科大学第五附属医院，乌鲁木齐830011； 2 上海市浦东新区人民医院

研究[1]显示，缺血性心脏病和心内膜心肌纤维化是终末期心力衰竭的主要原因，其中心肌纤维化可导致心肌病理性重构、心功能恶化，增加患者死亡风险，与疾病预后密切相关[2]。既往大量研究[3]证实，TGF-β/Smad信号通路与心血管疾病密切相关，在心脏收缩功能、血管再生、心肌肥大和纤维化中均有重要的调控作用。研究[4]显示，原癌基因c-SKI对TGF-β1/Smad信号通路存在负性调节作用。本课题组前期研究[5]发现，过表达c-SKI可显著抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞增殖和分化，并可抑制胞外基质的合成，在离体实验中证实c-SKI具有抑制心肌纤维化的作用，但是其能否同样有效改善小鼠心肌纤维化尚未得到进一步验证。2017年1月～2019年12月，本研究利用心肌纤维化小鼠模型，观察尾静脉注射c-SKI过表达慢病毒重组质粒对心肌纤维化小鼠心室重构、心肌组织纤维化的改善作用，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 质粒、动物 c-SKI过表达的慢病毒重组质粒pLVX-IRES-Puro-SKI购自湖南长沙赢润生物技术有限公司。C57雄性小鼠40只，8周龄，体质量(20±2)g，由新疆医科大学实验动物研究中心提供。

1.2 动物分组、心肌纤维化模型制作及c-SKI慢病毒质粒给予方法 将40只小鼠随机分为对照组、模型组、模型+c-SKI慢病毒质粒转染组(LV-SKI组)和模型+空白病毒质粒转染组(LV-NC组)，每组10只。模型组、LV-SKI组、LV-NC组采用皮下注射异丙肾上腺素(第1天5 mg/kg，第2～30天2.5 mg/kg)的方法构建小鼠心肌纤维化模型。LV-SKI组在建模第18天开始每隔3天尾静脉注射c-SKI过表达的慢病毒重组质粒pLVX-IRES-Puro-SKI，病毒滴度1×108TU，剂量100 μL，持续至30天；LV-NC组在建模第18天开始每隔3天尾静脉注射空白病毒质粒，病毒滴度1×108TU，剂量100 uL，持续至30天；模型组注射等量生理盐水；对照组不作处理。

1.3 各组小鼠心肌重构判断指标观察

1.3.1 各组小鼠心功能指标观察 取各组小鼠，腹腔注射2%异氟烷诱导麻醉后，仰卧位固定，应用美国惠普Sonos 5500超声仪及15 MHz高频线阵探头行经胸超声检查，观察并记录心率(HR)、左心室收缩末期内径(LVIDs)、舒张末期内径(LVIDd)、左室射血分数(EF%)、左心室短轴缩短率(FS%)。

1.3.2 各组小鼠心脏重量(HW)、左心室重量(LVM)、心脏质量指数(HMI)、左心室质量指数(LVMI)测算 取各组小鼠，腹腔注射1～2 mL/kg戊巴比妥麻醉小鼠，迅速取出心脏，滤纸吸干水分后称取HW，分离出左、右心房和左、右心室，并称取LVM，计算HMI和LVMI。HMI=HM/BM，LVMI=LVM/BM。

1.4 各组小鼠心肌组织纤维化判断指标观察

1.4.1 各组小鼠心肌组织观察及胶原容积分数(CVF)测算 取各组小鼠心脏组织标本，置于盛有10%甲醛水溶液中固定，石蜡包埋、切片，按Masson染色试剂盒操作流程操作，使用Image-ProPlus软件镜下观察拍照，并计算胶原容积分数(CVF)。显微镜下，心肌组织为红色，胶原纤维为蓝色。CVF=胶原纤维染色面积/切片总面积×100%。

1.4.2 各组小鼠心肌组织中Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白检测 采用免疫组化法。取各组小鼠心脏组织标本，脱水、透明、浸蜡、包埋、切片机烤片，用0.01 mmol/L枸橼酸缓冲液进行抗原修复，3%过氧化氢清除内源性过氧化物酶活性，3%的BSA室温封闭30 min，把湿盒放在4 ℃孵育一抗Ⅰ型胶原(1∶500)、Ⅲ型胶原(1∶500)过夜。第2天按试剂盒说明书孵育二抗，DAB显色,苏木素复染2 min后清洗，于乙醇梯度脱水后，二甲苯浸泡、干燥、封片，镜下观察并拍照，Image-J 6.0软件分析。将对照组小鼠Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的相对表达量均设为1，计算其他各组小鼠Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的相对表达量。

1.5 各组小鼠心肌组织中Smad3、P-Smad3蛋白检测及P-Smad3/Smad3测算 采用Western Blotting法。取心脏组织剪碎，加入RIPA裂解液，使用超声破碎仪裂解2 min后，静置30 min，12 000 r/min高速离心10 min，留取上清，按BCA蛋白定量法进行蛋白定量。取样本40 μg进行SDS-PAGE，转PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭60 min，分别加入P-Smad3、GAPDH、Smad3特异性一抗，4℃孵育过夜，漂洗后加入相应的二抗室温孵育2 h，TBST洗膜3次，用ECL发光试剂盒显色，Bio-Rad成像系统拍照，ImageLab 6.0软件软件分析，计算心肌组织中Smad3、P-Smad3蛋白的相对表达量和P-Smad3/Smad3。目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值×100%。

2 结果

2.1 各组小鼠心肌重构判断指标比较

2.1.1 各组小鼠心功能指标比较 ①对照组小鼠HR、LVIDs、LVIDd、EF%、FS%分别为(396.60±6.64)次/min、(1.43±0.13)mm、(2.84±0.27)mm、84.27%±4.69%、42.3%±2.31%，模型组分别为(431.1±9.75)次/min、(2.59±0.31)mm、(4.35±0.32)mm、53.14%±6.03%、30.1%±3.14%，两组相比，P均<0.01。②LV-NC组小鼠HR、LVIDs、LVIDd、EF%、FS%分别为(429.9±7.31)次/min、(2.89±0.29)mm、(4.32±0.35)mm、50.48%±4.29%、31.8%±4.45%，LV-SKI组分别为(401.6±9.64)次/min、(2.19±0.41)mm、(3.98±2.68)mm、58.9%±4.75%、37.2%±2.25%，两组相比，P均<0.01。

2.1.2 各组小鼠心脏HW、LVM、HMI和LVMI比较 ①对照组小鼠HW、LVM、HMI、LVMI分别为(125.1±4.78)mg、(104.3±5.83)mg、(4.54±0.39)mg/g、(4.36±0.42)mg/g，模型组分别为(140.5±7.32)mg、(118.4±6.89)mg、(5.94±0.56)mg/g、(5.41±0.29)mg/g，两组相比，P均<0.01。②LV-NC组小鼠HW、LVM、HMI、LVMI分别为(141.9±5.15)mg、(121.6±5.89)mg、(6.07±0.56)mg/g、(5.39±0.48)mg/g，LV-SKI组分别为(134.5±5.26)mg、(111.6±4.12)mg、(5.38±0.33)mg/g、(4.90±0.46)mg/g，两组相比，P均<0.01。

2.2 各组小鼠心肌组织纤维化判断指标比较

2.2.1 各组小鼠心肌组织及CVF比较 对照组可见心肌组织红染，心肌细胞间可见少量胶原纤维，模型组心肌细胞结构紊乱，间隔显著增宽，间质增多，可见有大量束状的蓝色胶原纤维；与模型组和LV-NC组相比，LV-SKI组上述病理变化有所减轻，心肌细胞数目有所增加，胶原纤维减少。对照组小鼠CVF为3.85%±0.61%、模型组为32.54%±3.12%，两组相比，P<0.01。LV-NC组小鼠CVF为33.61%±2.61%、LV-SKI组为25.71%±2.28%，两组相比，P<0.01。

2.2.2 各组小鼠心肌组织中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白相对表达量比较 ①对照组小鼠Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的相对表达量均设为1，模型组分别为3.03±0.39、3.87±0.27，两组相比，P均<0.01。②LV-NC组小鼠Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的相对表达量分别是3.11±0.19、3.84±0.26，LV-SKI分别为2.43±0.26、2.61±0.24，两组相比，P均<0.01。

2.3 各组小鼠心肌组织中P-Smad3/Smad3比较 ①对照组小鼠P-Smad3/Smad3为0.64±0.06，模型组为1.39±0.02，两组相比，P<0.05。②LV-NC组小鼠P-Smad3/Smad3为1.31±0.06，LV-SKI组为0.89±0.05，两组相比，P<0.05。

3 讨论

心肌纤维化属于心肌中的瘢痕事件，主要以心肌成纤维细胞的活化、向肌成纤维细胞的分化和胶原蛋白增加为特征。成人心肌的主要成分是Ⅰ型胶原蛋白(约85%)和Ⅲ型胶原蛋白(约11%)，在正常的心肌中，胶原纤维对心肌收缩力的传递至关重要，在各种病理损伤后，胶原蛋白出现比例失调和异常沉积，使得心肌僵硬度增加，出现病理性重构，导致心功能障碍甚至衰竭。因此，积极的抑制或逆转心肌纤维化进程，可有效改善或延缓心力衰竭的发生发展，改善患者的生活质量和预后。

原癌基因c-SKI在机体发育和组织稳态中都有重要作用，具有广泛的生物学效性。目前关于c-SKI在心肌纤维化的调控方面的研究较少。研究[6]发现，沉默c-SKI的表达能够促进TGF-β1诱导心肌细胞H9C2发生上皮间质转化，促进心肌纤维化。沉默c-SKI还可以通过抑制ERK/CREB信号通路抑制心肌成纤维细胞增殖。最新研究[7]报道，过表达c-SKI可以减少房颤的发作以及发作持续时间，抑制心肌纤维化并改善心肌重构。此外，miR-34a/miR-93可以靶向c-SKI抑制心肌成纤维细胞增殖和胞外基质沉积。本研究发现，给予异丙肾上腺素皮下注射30天后，模型组小鼠心脏超声显示LVIDs、LVIDd、HMI、LVMI均显著升高，提示心肌出现病理性重构；模型组小鼠心肌细胞可见结构紊乱，间隔显著增宽，间质增多，大量的胶原纤维沉积，CVF升高，进一步的免疫组化结果证实Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白相对表达量增多，均提示小鼠出现了胞外基质沉积，发生心肌纤维化病理改变。过表达c-SKI后，与LV-NC组相比，LV-SKI组心脏超声结果显示LVIDs、LVIDd、HMI和LVMI均有所降低，EF%、FS%值则相对增加；Masson染色和免疫组化结果表明，与LV-NC组相比，LV-SKI组心肌细胞数目有所增加，胶原纤维减少，同时Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白相对表达量有所下降。可见，过表达c-SKI具有抑制心肌纤维化和胶原蛋白沉积作用，从而改善心肌重构和心功能。

TGF-β/Smad信号通路与心肌纤维化关系最为密切，其中Smad蛋白是通路下游的关键效应蛋白，而c-SKI则主要是通过抑制Smad蛋白的表达负性调控该通路的活性。研究[8]发现，在成纤维细胞中，c-SKI通过作用于TGF-β/Smad通路调节心肌纤维化进程。在心肌梗死小鼠模型中，c-SKI可通过抑制P-Smad2和P-Smad3蛋白的表达，抑制TGF-β/Smad通路激活，最终抑制心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，减少胞外基质的沉积。同样的，c-SKI通过抑制TGF-β1/Smad号通路改善犬房颤模型心房重构，抑制心房纤维化进程。此外，过表达c-Ski可通过调控Smad3信号通路促进胃癌相关成纤维细胞的增殖、侵袭和迁移，以及通过抑制Smad3表达诱导肺癌患者耐药。本研究结果发现，过表达c-SKI可以抑制小鼠心肌细胞中P-Smad3/Smad3的表达，与既往研究结果基本一致。而最新研究[9]表明，c-SKI是通过抑制PI3K/Akt信号通路来减少骨肉瘤细胞的增殖和迁移，由此可见c-SKI作用丰富且具多样性，需要更全面的去了解。

综上，本研究在前期研究的基础上，进一步发现在异丙肾上腺素诱导的小鼠心肌纤维化进程中，过表达c-SKI可以减轻小鼠心肌组织中纤维组织增生、胶原纤维减少，减少胞外基质的沉积，具有一定抗心肌纤维化的作用，同时可以改善心功能、抑制心肌病理性重构，为心肌纤维化相关研究提供了理论基础。