脑胶质瘤组织中差异表达基因的生物信息学分析及肿瘤发生发展关键调控基因筛选

郑诗豪，陈忠仪，黄绍崧，刘宇清，黄绳跃

福建省立医院，福州350001

脑胶质瘤是颅内最常见的原发性高度恶性肿瘤，约占所有神经肿瘤的30%，恶性脑肿瘤的80%[1]。根据2016年世界卫生组织(WHO)的指南，结合组织病理学和最新的分子生物学特征，脑胶质瘤可划分为Ⅰ～Ⅳ级。脑胶质瘤的治疗方法主要包括手术切除、术后辅助放疗和化疗，但脑胶质瘤的临床治疗效果仍不能令人满意[2]。研究[3]显示，恶性程度最高的胶质母细胞瘤患者中位生存期只有14个月。虽然与胶质瘤母细胞瘤相比，低级别脑胶质瘤表现出较为良性的生物学特性与较好的预后，但仍存在相当高的复发率，并且随着时间的推移，其恶性程度与WHO分级也相应增加[4]。脑胶质瘤的发病机制涉及多个因素和步骤，包括遗传和表观遗传改变，尽管多种脑胶质瘤的致癌机制已被证实，如p53和受体酪氨酸激酶信号通路等[5]，但我们对脑胶质瘤发生发展的确切机制仍知之甚少，因此与脑胶质瘤发生发展相关的重要分子标志物仍需进一步探寻。本研究基于基因公共表达数据库(GEO数据库)，通过筛选出脑胶质瘤组织与正常脑组织之间的差异表达基因，采用生物信息学方法对差异表达基因进行GO功能富集、KEGG信号通路分析、关键调控基因筛选，为深入研究脑胶质瘤的发生发展提供新的基因靶点。

1 资料与方法

1.1 脑胶质瘤组织与正常脑组织基因表达谱数据的选择与获取 从GEO数据库中选择并下载编号为GSE2223的脑胶质瘤表达谱芯片，该芯片基于GPL1833平台SHFK检测，由49例脑胶质瘤以及4例人类正常脑组织样本组成，提取该芯片中脑胶质瘤组织与正常脑组织的基因表达谱数据用于后续数据分析。49例脑胶质瘤中包含31例胶质母细胞瘤、2例毛细胞星形细胞瘤、1例低级别星形细胞瘤、1例间变型星形细胞瘤、8例少突胶质细胞瘤、6例间变型少突星形细胞瘤。

1.2 脑胶质瘤组织与正常脑组织差异表达基因的提取与筛选 利用R语言将芯片中脑胶质瘤组织与正常脑组织的基因表达谱数据的表达强度归一化，使得表达强度在一组阵列上具有相似的分布。利用R语言limma包，设置筛选条件为差异倍数>4倍且P<0.05(logFoldChange>2&adjustP<0.05)，筛选出芯片中脑胶质瘤组织与正常脑组织的差异表达基因。

1.3 差异表达基因的基因本体(GO)功能富集和KEGG信号通路分析 使用R语言的org.Hs.eg.db包对筛选出的差异表达基因进行GO功能富集，包括差异表达基因参与的生物学过程、细胞组分以及分子功能三个层面，取P<0.05且P值最显著的前10个结果。利用DAVID 6.8在线分析网站对筛选出的差异表达基因参与的KEGG信号通路分析，下载分析结果后应用R语言ggplot2包按照P<0.05条件筛选出排名前10的信号通路。

1.4 脑胶质瘤发生发展关键调控基因的筛选 将筛选出的脑胶质瘤组织与正常脑组织差异表达基因导入STRING网站，构建差异表达基因编码的蛋白间相互作用(PPI)网络图，设置筛选标准为蛋白间相互作用得分(interactionscore)>0.4，剔除无相互作用的孤立蛋白，整理成最后的PPI网络图并进行可视化处理，根据蛋白间临近相互作用对计数，选取前20个差异表达基因，即为可能参与脑胶质瘤发生发展的关键调控基因。

2 结果

2.1 脑胶质瘤组织与正常脑组织差异表达基因筛选结果 共筛选出107个差异表达基因，与正常脑组织相比，脑胶质瘤组织中上调的基因48个、下调的基因59个。上调的基因为PRRX1、GPR34、NES、TSKU、EHD4、CXCL16、ABCA1、NID1、PXDN、MTHFD2、SLCO2B1、LST1、TYROBP、VSIG4、TIMP4、ZNRD1-AS1、MST1L、S1PR3、MB、LILRB4、ITGA7、BBOX1、MAFB、RUNX1、CRISPLD1、SLAMF8、UHRF1、TCEB3、GATSL3、ID3、MS4A4A、MS4A6A、COL4A2、PLEK、CDKN1A、ITGA5、MS4A6E、SRGN、CCL11、KCNMB1、UBE2C、CLEC5A、IFI44L、TNFRSF12A、SOX4、SPOCD1、IL33、CLCF1。下调的基因为HPCAL1、PNMAL2、PDE1B、MAL2、CAMK2A、CAP2、RAB3B、PHOX2B、PAK1、TMEM155、CAMK2B、ITPR1、MRAP2、RGS4、SNCG、CYP26A1、BCL11A、LINGO2、GABRA1、NUCB1、NRIP3、MAP7D2、HS6ST3、SNCA、KCNAB2、RAB27B、GDA、CAMKV、STXBP5L、RBFOX1、STXBP1、SULT4A1、RAB3A、VSTM2A、HPCAL4、CDK5R2、SOWAHA、CLEC2L、RYR2、FGF13、OSTM1-AS1、NAPB、SYP、FBXL16、L1CAM、MAST3、MARCKSL1、NEFL、CPLX2、PITPNM3、PHYHIP、INA、NRGN、TF、UBE2QL1、WBSCR17、LGI3、CACNG2、GAD2。

2.2 差异表达基因的GO功能富集和KEGG信号通路分析结果 GO功能富集结果显示，差异表达基因在细胞组分上的改变主要表现在运输囊泡膜、神经远端轴突、神经轴突、突触囊泡、突触囊泡膜、运输囊泡膜等结构上，分子功能变化主要集中在突触融合蛋白、钙调蛋白、磷脂酶结合蛋白、肌凝蛋白及突触后的结构等功能上；生物学过程体现在神经递质分泌、运输及释放、突触囊泡周期的调节、神经突触跨突触信号传导等生物学过程上。KEGG信号通路分析结果显示，差异表达基因与肿瘤蛋白聚糖通路、催产素信号通路、胰岛素分泌通路、钙信号通路、HIF-1信号通路、ErbB信号通路等有关。

2.3 脑胶质瘤发生发展关键调控基因的筛选结果 构建的PPI网络图由136个节点、75个蛋白相互作用构成,PPI网络图中蛋白间相互作用对数前20的差异表达基因分别为CAMK2A、CPLX2、SYP、RAB3A、GABRA1、TYROBP、CAMK2B、NEFL、STXBP1、VSIG4、GAD2、RBFOX1、HPCAL4、NRGN、PNMAL2、CDK5R2、LGI3、ABCA1、COL4A2，ITPR1，可能为参与脑胶质瘤发生发展的关键调控基因。

3 讨论

本研究挑选GEO数据库中编号为GSE2223的表达谱芯片，芯片数据由49例脑胶质瘤肿瘤组织样本、4例脑组织样本组成，共筛选出107个差异表达基因，这些基因都可能与脑胶质瘤的发生发展相关，进一步进行GO功能富集和KEGG信号通路分析。GO功能富集结果显示，脑胶质瘤在细胞组分上的改变主要表现在神经突触、神经轴突、突触囊泡、突触囊泡膜、运输囊泡膜上，分子功能变化主要集中在突触融合蛋白、钙调蛋白、磷脂酶、肌凝蛋白及突触后的结构上，生物学过程体现在神经递质分泌、运输、传递以及神经信号传导等变化。本研究中，GO功能富集结果的三个层面都一致提示脑胶质瘤的进展与神经元活动相关。在正常的脑组织中，神经活动诱导神经胶质干细胞和祖细胞的增殖，并通过谷氨酸酰能的突触引导他们的迁移[6,7]。Venkatesh和Venkataramani等[8,9]两篇研究报告表明，脑胶质瘤细胞上的神经元过度兴奋可刺激谷氨酸酰能突触，进而激活肿瘤细胞间钙信号网络，促进多级细胞致癌信号级联和细胞骨架重塑，从而促进脑胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力。Venkatesh等[10]认为，神经元活动在脑胶质瘤的增殖过程中起着重要作用，进一步研究发现突触黏附分子神经胶质素3可通过PI3K-mTOR通路促进脑胶质瘤的增殖。目前神经活动与脑胶质瘤相关的研究仍鲜有报道，因此神经元活动在脑胶质瘤中所起的作用值得进一步探讨和发现。

KEGG信号通路分析结果显示，差异表达基因参与介导了癌症中蛋白聚糖通路、催产素信号通路、胰岛素分泌通路、钙信号通路、HIF-1信号通路、ErbB信号通路等多条信号通路。在癌症中，蛋白聚糖可驱动肿瘤细胞中的多种致癌途径，并在肿瘤微环境中起着重要作用。Wade等[11]提出蛋白聚糖激活了肿瘤细胞受体酪氨酸激酶信号通路，从而促进胶质母细胞瘤的发生发展。越来越多的证据[12]也表明，钙可能是脑胶质瘤中发生发展的重要正向调节因子，其作用涉及肿瘤细胞增殖、迁移、凋亡等功能。

本研究通过PPI网络图进一步筛选出影响脑胶质瘤发生发展的前20个关键调控基因，其中部分基因已在脑胶质瘤中有相关研究报道，如RAB3A基因，它与正常大脑突触囊泡的运输有关。KIM等[13]研究发现，RAB3A基因可促进脑胶质瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性，并可促进维持干性。WANG等[14]研究证实，miR-25和miR-183可靶向调控NEFL基因促进胶质母细胞瘤的增殖。VSIG4基因已被发现可诱导脑胶质瘤细胞发生上皮-间质转化，并促进细胞的侵袭和迁移，并且在脑胶质瘤患者中发现高表达VSIG4患者的预后不良。但本次筛选出的大部分关键调控基因目前在脑胶质瘤中的研究较少，值得我们进一步探究。

目前关于脑胶质瘤发生发展的分子生物学研究成果正在逐渐应用于临床。2016年，WHO在脑胶质瘤组织分型的基础上增加了分子分型的分类，有力推动了脑胶质瘤的精准诊断和治疗的进程。但是脑胶质瘤发生发展主要机制仍不明确，因此仍需在基因层面深入探寻脑胶质瘤发病的机理。本研究基于GEO数据库中GSE2223芯片数据深入挖掘脑胶质瘤的差异表达基因，通过GO功能富集和KEGG通路分析预测了其可能的发病机制，并构建了差异表达基因的PPI网络图，筛选了可能参与脑胶质瘤发生发展的关键调控基因，初步揭示了脑胶质瘤发生发展相关的靶点、信号通路，为今后的基础研究与临床诊治提供了新的思路和方向。