lncRNA TDRG1、miR-194-3p在直肠癌组织中的表达变化及其对直肠癌细胞凋亡和放疗敏感性影响观察

赵刚，武青生，赵延礼，马生彪，王巍，穆元忠

1 青海省第五人民医院，西宁810000；2 青海大学医学院

直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，根治性手术是临床治疗直肠癌的主要策略，但由于直肠解剖位置复杂，手术不易彻底清除，术后复发率高。为延长直肠癌患者的生存期，常常辅以放疗。然而，由于部分患者出现放疗抵抗，大大降低了放疗效果。因此，探究如何减少放疗抵抗，提高放射敏感性并促进肿瘤细胞凋亡具有重要意义。近年来多项研究[1]表明，长链非编码RNA(lncRNA)异常表达与肿瘤细胞放疗敏感性相关。研究[2]显示，lncRNA睾丸发育相关基因1(TDRG1)在子宫内膜癌、卵巢癌、精原细胞瘤等多种恶性肿瘤中表达上调，与肿瘤的发生、转移和化疗耐药密切相关。但lncRNA TDRG1和放疗敏感性的相关研究较少。本研究观察了lncRNA TDRG1、微小RNA-194-3p(miR-194-3p)在直肠癌组织中的表达变化，及其对直肠癌细胞凋亡、放疗敏感性的影响，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 直肠癌细胞和试剂 人直肠癌细胞系SW1643购自美国ATCC公司，Qiagen RNeasy Mini试剂盒、SYBR Green Master Mix购自杭州沃森生物技术有限公司，DMEM培养液、胎牛血清、青链霉素溶液购自美国Gibco公司，PCR引物、lncRNA TDRG1小干扰RNA序列si-TDRG1及其对照si-NC、miR-194-3p mimics及其对照miR-NC、miR-194-3p抑制物anti-miR-194-3p及其对照anti-miR-NC购自上海英骏公司，膜联蛋白V异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)细胞凋亡检测试剂盒、放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解缓冲液购于上海碧云天生物公司；兔源B细胞淋巴瘤(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体、山羊抗兔二抗购自美国CST公司，实时荧光定量PCR检测系统购自美国Bio-Rad公司，流式细胞仪购自美国Beckman公司。

1.2 直肠癌组织和癌旁组织的收集及组织中lncRNA TDRG1、miR-194-3p检测 本研究共收集30对直肠癌组织及与其对应的癌旁组织(距离癌灶5 cm以上的肠壁组织)，样本均经标准程序进行手术切除，并经病理学确诊。所有样本采集者均签署知情同意书，并获得医院伦理委员会批准。采用RNeasy Mini试剂盒分别从直肠癌组织、癌旁组织中分离总RNA，利用ThermoScript RT-PCR系统将2 μg总RNA逆转录为cDNA，并利用SYBR Green Master Mix和roche Light Cycler 96进行定量PCR。引物序列如下：TDRG1上游引物为5′-TCTTCCCTGGCTTGGC-3′，下游引物为5′-TGGGCTCTTTCGTGGC-3′；miR-194-3p上游引物为5′-ACACTCCCAGUGGGGCUG-3′，下游引物为5′-CAGAUAACAGTTGAGAGTACAT-3′；GAPDH上游引物为5′-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3′，下游引物为5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′；U6上游引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物为5′-AACGCTTCACGAATTTGCG-3′。以U6和GAPDH为内参，以2-ΔΔCt表示组织中lncRNA TDRG1、miR-194-3p的相对表达量。

1.3 lncRNA TDRG1靶基因预测验证 使用LncBase Predicted v.2在线预测网站分析lncRNA TDRG1的靶基因，发现lncRNA TDRG1的序列中含有与miR-194-3p互补的核苷酸序列，提示lncRNA TDRG1直接靶向miR-194-3p。采用双荧光素酶报告基因实验验证lncRNA TDRG1的靶基因：构建含有miR-194-3p结合位点的野生型荧光素酶报告基因载体WT-TDRG1、含有miR-194-3p结合位点突变序列的突变型荧光素酶报告基因载体MUT-TDRG1，将miR-194-3p mimics、miR-NC分别与WT-TDRG1、MUT-TDRG1共转染至SW1643细胞，转染48 h后，使用双荧光素酶报告基因检测系统测定荧光素酶活性。

1.4 细胞培养和实验分组 SW1643细胞采用含10%胎牛血清、1%青链霉素溶液的DMEM培养液置于5%CO2、37 ℃恒温培养箱中传代培养。将对数生长期SW1643细胞按照2×105个/孔的细胞密度接种于6孔板，利用脂质体转染试剂分别将si-TDRG1、si-NC、miR-194-3p mimics、miR-NC、si-TDRG1+anti-miR-194-3p、si-TDRG1+anti-miR-NC分别转染SW1643细胞，分别记为si-TDRG1组、si-NC组、miR-194-3p组、miR-NC组、、si-TDRG1+anti-miR-194-3p组si-TDRG1+anti-miR-NC组，转染48 h后检测转染效率，合格后进行后续实验分析。

1.5 各组细胞凋亡率测算 采用流式细胞术。各组细胞转染48 h后，收集细胞并重悬于结合缓冲液中，调整细胞密度为1×106个/mL。取100 μL细胞悬液，按照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒使用说明，检测各组细胞凋亡情况，计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=(早期凋亡数+晚期凋亡数)/细胞总数×100%。实验重复3次，取平均值。

1.6 各组细胞中Bcl-2、Bax蛋白检测 采用Western blotting法。取各组细胞，RIPA裂解缓冲液裂解细胞，获得细胞蛋白。配置浓缩胶和分离胶，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞蛋白，转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，并在5%牛血清蛋白中于室温封闭1 h。封闭后，将膜置于1∶1 000稀释的Bcl-2、Bax、GAPDH抗体溶液中孵育1 h，TBST洗膜，将膜置于相应的1∶1 000稀释的二抗溶液中孵育1 h。采用增强的化学发光试剂盒进行显影，Image J软件进行光密度测定，以目的蛋白和GAPDH光密度值比值表示目的蛋白的相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.7 各组细胞放疗敏感性测算 采用克隆形成实验。将各组细胞接种到6孔板，分别采用0、2、4、6、8 Gy剂量射线照射细胞，照射后将各组细胞置于5%CO2、37 ℃恒温培养箱中培养，当出现肉眼可见的克隆时，终止培养、甲醇固定、结晶紫染色，计数≥50个细胞的克隆数，计算细胞存活分数，并利用GraphPadPrism 5软件绘制每个实验的存活曲线，计算放射增敏比(SER)。SER是反应放射敏感性的主要参数。SER>1表示放射敏感性增强，SER<1表示放射敏感性降低。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 直肠癌组织和癌旁组织中lncRNA TDRG1、miR-194-3p相对表达量比较 直肠癌组织中lncRNA TDRG1、miR-194-3p的相对表达量分别为3.15±0.33、0.58±0.05，癌旁组织中lncRNA TDRG1、miR-194-3p的相对表达量分别为1.01±0.08、1.00±0.09，两者相比，P均<0.05。

2.2 lncRNA TDRG1靶基因验证结果 转染WT-TDRG1、miR-194-3p mimics的SW1643细胞荧光素酶活性为0.36±0.04，转染WT-TDRG1、miR-NC的SW1643细胞荧光素酶活性为1.00±0.09，两者相比，P<0.05；转染MUT-TDRG1、miR-194-3p mimics的SW1643细胞荧光素酶活性为1.01±0.09，转染MUT-TDRG1、miR-NC的SW1643细胞荧光素酶活性为0.99±0.08，两者相比，P>0.05。

2.3 各组细胞凋亡率比较 si-TDRG1组、si-NC组细胞凋亡率分别为22.14%±2.21%、6.98%±0.65%，两组相比，P<0.05。miR-194-3p组、miR-NC组细胞凋亡率分别为19.65%±1.84%、7.12%±0.71%，两组相比，P<0.05。si-TDRG1+anti-miR-194-3p组、si-TDRG1+anti-miR-NC组细胞凋亡率分别为13.47%±1.35%、23.34%±2.33%，两组相比，P<0.05。

2.4 各组细胞中Bcl-2、Bax蛋白相对表达量比较 si-TDRG1组Bcl-2、Bax蛋白相对表达量分别为0.32±0.03、0.68±0.06，si-NC组Bcl-2、Bax蛋白相对表达量分别为0.72±0.07、0.23±0.03，两组相比，P均<0.05。miR-194-3p组Bcl-2、Bax蛋白相对表达量分别为0.37±0.03、0.62±0.06，miR-NC组Bcl-2、Bax蛋白相对表达量分别为0.74±0.07、0.22±0.03，两组相比，P均<0.05。si-TDRG1+anti-miR-194-3p组Bcl-2、Bax蛋白相对表达量分别为0.62±0.05、0.35±0.03，si-TDRG1+anti-miR-NC组Bcl-2、Bax蛋白相对表达量分别为0.31±0.03、0.69±0.05，两组相比，P均<0.05。

2.5 各组细胞放疗敏感性比较 si-TDRG1组、si-NC组细胞存活分数分别为0.330、0.657，SER为2.016。miR-194-3p组、miR-NC组细胞存活分数分别为0.370、0.669，SER为1.913。si-TDRG1+anti-miR-194-3p组、si-TDRG1+anti-miR-NC组细胞存活分数分别为0.547、0.320，SER为0.574。

3 讨论

越来越多的研究[3，4]证实，许多lncRNA在直肠癌发生发展中起关键作用。本研究通过RT-qPCR检测证实，直肠癌组织中lncRNA TDRG1的表达较其邻近正常组织显著升高，并通过功能实验证实lncRNA TDRG1在直肠癌中具有致癌因子作用，干扰lncRNA TDRG1表达可诱导直肠癌细胞SW1643凋亡、降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达、升高促凋亡蛋白Bax的表达水平，并提高其放疗敏感性。与本研究结果类似，lncRNA TDRG1在宫颈癌、卵巢癌等恶性肿瘤中均发挥致癌作用。研究[5]显示，宫颈癌组织和癌细胞中lncRNA TDRG1的表达明显增加，其高表达促进宫颈癌细胞的增殖和迁移。lncRNA TDRG1高表达与精原细胞瘤的恶性生物学行为和肿瘤分期具有相关性，干扰lncRNA TDRG1表达可降低NTERA-2细胞增殖和侵袭能力，并提高其凋亡水平。此外，干扰lncRNA TDRG1表达还可提高精原细胞瘤TCam-2细胞对顺铂的化学敏感性[6]。以上研究说明，干扰lncRNA TDRG1表达可促进直肠癌细胞凋亡，并提高其放疗敏感性。

研究[7]显示，lncRNA中含有miRNA结合位点，可通过发挥miRNA海绵作用拮抗其功能。研究[5]发现，lncRNA TDRG1通过海绵作用拮抗miR-330-5p对ELK1的抑制作用，从而促进宫颈癌进展。为揭示TDRG1在直肠癌中的作用机制，采用生物信息学网站LncBase Predicted v.2在线预测miR-194-3p与lncRNA TDRG1之间存在潜在结合位点，随后通过双荧光素酶实验确定miR-194-3p为lncRNA TDRG1在直肠癌细胞SW1643中的靶miRNA。先前研究[8]表明，miR-194-3p在胶质瘤中具有抑癌因子作用，过表达miR-194-3p可抑制胶质瘤细胞的干细胞特性。同时，过表达miR-194-3p还可增强鼻咽癌细胞放疗敏感性和细胞凋亡，抑制细胞迁移、侵袭和增殖，并抑制裸鼠成瘤。此外，过表达miR-194-3p还可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖和迁移。本研究结果显示，直肠癌组织中miR-194-3p呈低表达，且lncRNA TDRG1能负性调控miR-194-3p表达，于是推测miR-194-3p在直肠癌中具有抑癌作用。进一步功能实验显示，过表达miR-194-3p促进直肠癌细胞SW1643凋亡、抑制Bcl-2表达、促进Bax表达，并提高SW1643细胞放疗敏感性。此外，抑制miR-194-3p表达可逆转干扰lncRNA TDRG1对SW1643细胞凋亡和放疗敏感性的影响。以上研究提示，lncRNA TDRG1通过靶向调控miR-194-3p影响直肠癌细胞的凋亡和放疗敏感性。

综上所述，直肠癌组织中lncRNA TDRG1高表达、miR-194-3p低表达；干扰lncRNA TDRG1表达和过表达miR-194-3p均可诱导直肠癌细胞SW1643凋亡、降低Bcl-2蛋白相对表达量、升高Bax蛋白相对表达量、增强放疗敏感性；干扰miR-194-3p表达可逆转干扰lncRNA TDRG1对SW1643细胞凋亡和放疗敏感性的影响。干扰lncRNA TDRG1可能是通过靶向miR-194-3p促进直肠癌细胞凋亡，并提高其放疗敏感性，lncRNA TDRG1有望成为提高直肠癌放疗敏感性的治疗靶点。