易损斑块动物模型研究进展

王雪羽 田进伟

150001哈尔滨医科大学附属第二医院心内科，心肌缺血教育部重点实验室

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是心血管疾病最主要的独立危险因素。冠心病是心血管疾病中最主要的疾病，急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)是冠心病的一种严重类型，其致死率高，而易损斑块(vulnerable plaque，VP)破裂是不良心血管事件发生的首要原因。研究发现，约3/4的急性心肌梗死源于斑块破裂[1-2]。理想的VP动物模型能形成与人类晚期斑块类似的病变，并能产生与人类相似的心血管事件。

1 人类VP的特点

关于AS形成的机制，目前广泛认为在早期，由于内皮细胞的损伤，脂质和炎症细胞在内皮下沉积，巨噬细胞吞噬脂质变为泡沫细胞，随着炎症反应加重斑块逐渐进展，形成了早期的脂质条纹；而后大量的生长因子和炎症介质产生，平滑肌细胞由中膜向内膜迁移并增殖，摄取脂质成为泡沫细胞，在炎症作用下产生大量弹性蛋白和胶原纤维，脂质条纹逐渐变为纤维斑块；AS晚期，斑块增大，管腔变窄，血流动力学改变，纤维帽变薄，斑块破裂继发血栓形成[3]。此外，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)活性与细胞外基质降解有关，如MMP-9可增加弹性蛋白的降解，促进纤维帽破裂，在斑块形成和破裂中发挥重要作用[4-5]。斑块的稳定性由多种因素决定，它与脂质池大小、炎症细胞数量呈负相关，与纤维帽厚度呈正相关[6]。人类的VP主要表现为纤维帽薄、脂质核心大(通常占斑块总面积的30%～40%)、斑块内新生血管形成、斑块内出血、血管壁弹性减低、管壁向外扩张(外向重构)、炎症细胞增加(主要为巨噬细胞)、平滑肌细胞和胶原纤维减少和钙化减少[1，7]。

2 物种的选择

以往的AS动物模型包括猴、猪、狗、兔、鼠等。新西兰白兔是研究AS常用的动物之一，研究发现，新西兰白兔在高胆固醇饮食喂养下能快速形成高胆固醇血症，但其循环血脂主要以高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)为主，仅能形成早期脂质条纹，不能形成纤维斑块，且由于其肝脂肪酶活性低，容易形成肝脂肪沉积，因肝损伤导致死亡率增加[8]。尽管降低饮食中胆固醇比例、持续高脂喂养改为间断高脂喂养后，可出现更接近于人的富含平滑肌细胞的斑块[9]，但相较于猴和猪，其斑块形态在各个阶段上都与人有较大差异。由于猴和猪的基因组与人类具有高同源性，具有相似的脉管系统和相似的脂代谢过程，经颈动脉损伤和高脂喂养后能观察到其内皮退化、泡沫细胞沉积、内膜逐渐增厚、纤维帽变薄等与人类AS相似的病理过程[10-12]。仓鼠由于其胆固醇合成和分泌途径与人类相似，且是唯一表达胆固醇酯转运蛋白的啮齿类动物，近年来成为研究胆固醇代谢和AS广泛应用的模型之一[13]。应用不同的物种构建VP模型有其各自特点，具体参见表1。

表1 选择不同物种制备VP模型的优缺点比较

3 建模方式选择

3.1 影响代谢的因素

现在普遍认为，AS由多种原因引起，其中高龄、高血压、吸烟、血脂异常、糖耐量异常等均是AS的危险因素。

3.1.1 血脂异常 高脂血症，尤其高胆固醇血症，是AS最重要的独立危险因素。很早以前，人们便开始以高胆固醇或高脂饮食喂养来诱导AS形成，但由于动物的血脂代谢与人不尽相同，比如新西兰白兔所形成的高胆固醇血症以HDL-C为主，且HDL-C被认为是具有心血管保护作用的脂蛋白，而人类血循环脂蛋白以致AS的低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol， LDL-C)为主[9]。研究发现，仅在高胆固醇喂养条件下，尽管豚鼠血循环脂蛋白同人类相似，但其不能出现弥漫的内膜增厚、明显脂质核心等AS病理改变。而对于大型动物，单纯的高脂喂养虽然可以出现与人类相似的AS，但由于其斑块发生率低、可重复性差，成为构建VP模型的主要限制[12-14]。

3.1.2 糖耐量异常 糖尿病也是心血管疾病的独立危险因素。尽管糖尿病引起心血管疾病的机制尚未完全明确，但大量数据表明，空腹血糖每升高1.5 mmol/L或糖化血红蛋白每升高1%，心血管风险就增加近20%[15-16]。研究发现，有高血糖的载脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E-deficient ，ApoE-/-)小鼠比血糖正常的ApoE-/-小鼠更早形成晚期斑块。人们通过高糖饮食、肾上腺素刺激或通过应用胰岛β细胞毒性药物如链脲霉素、四氧嘧啶等造成高血糖[17]，诱导AS的形成。近年有编码胰岛素基因(Ins2AKITA)突变鼠与血脂异常ApoE-/-鼠杂交鼠的产生高血糖和高血脂环境，明显增加了VP的形成和心血管事件的发生[18]。

3.1.3 高血压 高血压能通过机械损伤血管内皮，引起脂质沉积、炎症细胞粘附来引起AS的发生。有报道表明，高血脂患者如合并高血压，其心血管事件的发生率将显著增加。Ning等[19]通过手术摘除WHHL(Watanabe heritable hyperlipidemic)兔一侧肾，并部分结扎另一侧肾动脉的方式成功构建VP模型。

3.2 物理损伤

3.2.1 直接损伤血管内皮 最常用的方法是球囊损伤，由于内皮细胞连续性被破坏，分泌粘附因子增加，引起单核细胞等在内皮下沉积变为巨噬细胞并产生炎症反应[20-21]，AS逐渐发生。相比于单纯高胆固醇喂养的新西兰兔形成的脂质条纹，球囊损伤冠状动脉能形成具有大脂质核心和纤维帽的晚期斑块[9]。球囊损伤结合高胆固醇喂养动物能在损伤部位观察到更剧烈的炎症反应和平滑肌细胞增生，形成更类似于人类的AS。而球囊损伤的不足在于损伤后可能发生急性血栓栓塞事件，且机械损伤无法模拟人类AS形成到破裂的病理过程[8]。也有研究用氯化铁成功诱导新西兰兔颈动脉内膜损伤，并成功检测到VP的形成[22]。

3.2.2 间接损伤血管内皮 主要通过改变血流动力学达成。AS斑块多发生在动脉分叉、狭窄或弯曲处，这些部位血流由层流变为涡流，使血流对管壁的剪切力改变[23]。血流动力学改变被认为是致AS的关键因素，其干预方式有以下几种：(1)完全结扎动脉：研究表明低血管剪切力与斑块形成有关，结扎颈总动脉分支近端[24]，由于结扎部位远端血流中断，近端血压仍存在，血流剪切力极低，可在结扎近端观察到快速发生的内膜增厚、斑块形成等，在血管紧张素Ⅱ的作用下可发生斑块破裂，此方法多用于血管重构分析、药物治疗、影像技术检测等研究；(2)部分结扎动脉：部分结扎ApoE-/-鼠颈动脉后1～4周，可逐渐观察到内皮功能障碍、AS形成、新生血管形成等病理过程[25]，在部分结扎颈动脉基础上再结扎肾动脉引起继发血压增高可观察到斑块破裂；(3)血管铸型：即用特定铸型改变管腔几何形状，可在铸型位置观察到纤维增生、泡沫细胞形成、脂质沉积等[26]，同时也能观察到MMP活性的增加[27]，有紧缩铸型、锥形、凸点形铸型等。在许多使用紧缩铸型的小鼠模型中皆观察到含少量脂质、多胶原和平滑肌的斑块，而在猪的紧缩铸型模型中却有无斑块形成、斑块形成、血栓栓塞等多种情形，具体原因有待研究；锥形铸型近端大，远端小，多用于研究血管剪切力在斑块形成中的作用，铸型两端皆可形成斑块：近端血管剪切力高，形成大而同心的斑块，而铸型远端剪切力低且波动，则形成偏心含大量炎症细胞的斑块[28]；(4)动静脉瘘：此法最初用于血液透析患者的透析治疗，由于静脉内膜的增生常导致动静脉瘘的失败，其原因可能是瘘成形后血流速度和血管剪切力的增加，使相应的炎症基因和蛋白表达变化，引起内皮功能紊乱、平滑肌增生、炎症细胞浸润和内膜增生，此模型多用于血管重构和斑块进展的研究[29]；(5)静脉桥：静脉桥用于血管闭塞性疾病的治疗，常由于内膜增生斑块形成导致冠脉搭桥失败。在静脉桥内发现弥漫的、同心的、具有大坏死核、纤维帽不完整的斑块，而人类的AS则为局灶的、偏心的、纤维帽覆盖良好，具体原因未明，可能由于管腔面积变化，静脉内血流速度减慢引起相应改变。这种模型用于对冠状动脉搭桥失败原因的研究，而不适用于AS发生发展的研究[7，29]。

3.3 药物作用

由于组胺、血管紧张素Ⅱ等有缩血管作用，可升高血压，增加斑块表面压力，用于诱导VP的破裂[30]。Xiong等[31]通过皮下注射P277短肽的方法诱导兔VP形成，P277是热休克蛋白60的一个短肽片段，可作为一种自身抗原，能引起多种免疫相关性疾病如自身免疫性关节炎、多发性硬化和AS等[32]。而在感染、应激、血流动力学改变等情况下，血管内皮细胞表达HSP增加。皮下注射P277可诱导免疫反应的发生，使CD4+T细胞攻击高脂喂养的动物血管内皮细胞，诱导VP的形成。尽管外源性给药方式能诱导VP破裂，但其与人类VP自发破裂的发生仍存在差异。

3.4 基因技术应用

小鼠因其繁殖期短、花费低等优点成为研究AS最受欢迎的动物之一。但与人类血脂成分不同，小鼠含有高水平的具有心血管保护作用的HDL-C，而致AS作用的LDL-C和极低密度脂蛋白胆固醇(very low-density lipoprotein，VLDL)含量低，因而小鼠不易形成斑块，但可利用基因敲除技术通过影响血脂代谢建立AS动物模型，如ApoE-/-小鼠模型和低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein receptor， LDLR)基因敲除小鼠模型(LDLR-/-)。ApoE存在于除LDL-C以外的脂蛋白中，作为细胞表面脂蛋白受体的配体，参与乳糜微粒和VLDL的清除。LDLR可识别LDL-C颗粒上脂蛋白B100，参与LDL-C的胞吞作用，也可以促进ApoB、ApoE的胞吞。ApoE-/-和LDLR-/-小鼠均是以C57BL/6小鼠为背景的基因敲除鼠，由于C57BL/6为近交品系鼠，相较于普通小鼠，其患冠心病的可能更高[33]，且因其基因组高度一致性，这两种鼠经高脂喂养后均能形成重复性高的VP。不同之处在于ApoE-/-小鼠在正常饮食下也能形成高脂血症，其血HDL-C水平也较正常小鼠和LDLR-/-低，可自发形成AS，高脂饮食可加速、加重其病变，而LDLR-/-小鼠在正常饮食下，仅能引起轻微的血胆固醇升高，需在高脂喂养后才出现AS[34]。 此外还有LDLR基因敲除兔，在正常饮食喂养下，其胆固醇水平16～20倍高于正常兔，也可形成大坏死核的斑块[35]。

弹性蛋白是血管壁和动脉粥样硬化斑块细胞外基质的重要组成部分，弹性纤维的破坏可引起动脉硬化，血管弹性减低[36]，而动脉硬化是心血管事件的危险因素。原纤蛋白1是合成微原纤维的重要成分，后者为弹性蛋白的沉积和交联提供支架。为明确原纤蛋白1在AS中的作用，研究人员利用ApoE-/-小鼠和原纤蛋白1基因中杂合突变的C1039G+/-小鼠杂交获得ApoE-/-C1039G+/-鼠，并发现ApoE-/-C1039G+/-鼠不论是否高脂喂养，均能观察到弹性纤维破裂、血管壁增厚、外向扩张等病理过程，均能形成至少两倍于高脂喂养的ApoE-/-小鼠的斑块面积[37]，而高脂喂养20周后ApoE-/-C1039G+/-鼠可观察到典型的VP特点：3倍于高脂喂养的ApoE-/-鼠的大脂质核心、大量的炎症细胞、典型薄纤维帽、丰富的新生血管和斑块内出血、斑块破裂和猝死；此外，MMP-12、MMP-2、MMP-9的表达也明显增高[37]。这种鼠较ApoE-/-鼠最大的优点为可形成有自发破裂倾向的VP，为减少心血管事件的研究提供新的动物模型。

4 展望

目前，研究人员已经建立了多种AS动物模型，但由于动物的基因组与人类存在本质的不同和干预方式的不同，目前仍然没有能完全符合人类AS过程的动物模型。但随着科学技术的发展和基因技术的运用，建立能产生与人类VP相似的动物模型有助于减少动物实验与人体实际的差异，为药物研究、器械耗材改进提供良好的动物基础，从而促进心血管事件的减少。

利益冲突：无