微小RNA-760在H9c2细胞中的表达及对凋亡的影响

卫训 汪凤仪 赵茂林

438700 黄冈，英山县人民医院心血管内科

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是全球发病率和致死率最高的疾病之一[1-3]。在心肌缺血再灌注(hypoxia/reoxygenation，H/R)过程中基因表达调控的分子机制仍未完全阐明。微小RNA(microRNAs，miRNAs)可以通过形成RNA诱导沉默复合体调节基因表达。研究显示，miRNAs在心脏的发育及病理进程中发挥着重要作用[4-5]，如敲除miR-1-2影响心脏形态、电传导和细胞周期[5]，过表达miR-320增加H/R导致的心肌细胞凋亡和心脏梗死面积[6]。研究发现，在AMI后，心脏中的miR-760表达水平显著下降[7]，但其所起的作用仍未明确。虽然原代培养的心肌细胞建立H/R模型能够相对更好地模拟临床心肌H/R损伤，但由于动物个体之间存在较大差异，原代培养的心肌细胞重复性和同一性较差，原代心肌细胞的培养及转染又有一定的困难和不确定性，故本实验采用H9c2细胞制备H/R损伤模型。通过观察miR-760在H/R后H9c2细胞中的表达，探讨其对心肌细胞凋亡的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

H9c2细胞(中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心)；DMEM培养基(Hyclone公司)；血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；胰蛋白酶、BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液、5×loading buffer、RNA提取试剂和逆转录试剂盒、CCK-8试剂盒及ECL超敏发光液(上海碧云天生物技术有限公司)；Bax兔单克隆抗体、Bcl-2兔单克隆抗体、cleaved caspase-3兔单克隆抗体、β-actin兔单克隆抗体和HRP标记抗兔抗体(Cell Signaling Technology公司)；Lipofectamine 2000(ThermoFisher Scientific公司)；miR-760 NC和mimics(上海吉玛制药有限公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(联科生物)。其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养 H9c2细胞使用含有10%FBS的DMEM培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养，每隔2 d更换培养基。

1.2.2 细胞H/R模型建立 H9c2细胞在完全培养基中培养3 d后，使用PBS洗涤，加入无血清无糖的缺氧液(NaCl 116 mM；KCl 50 mM；CaCl21.8 mM；MgCl2·6H2O 2 mM；NaHCO326 mM；NaH2PO4·2H2O 1 mM)后，将其置于通有5%CO2和95%N2的缺氧小室中37℃培养4 h。缺氧后，更换含有10%FBS的DMEM培养基，在5%CO2和95%O2中培养3 h进行复氧，细胞活力降低50%±10%判定为模型建立成功。

1.2.3 细胞转染及分组 将H9c2细胞6孔板按系统随机化法分为4组：对照组、模型组(H/R组)、阴性对照组(H/R+miR NC组)和H/R+miR-760 mimics组。使用Lipofectamine 2000将miR NC和miR-760 mimics转染至H9c2细胞；对照组细胞不做转染。H9c2细胞转染48 h后进行H/R处理。

1.2.4 CCK-8检测H9c2细胞活力 将H9c2细胞接种至96孔板，104个/孔。按上述方法处理后，加入CCK-8溶液10 μl/孔，放回孵育箱继续培养1 h后，于450 nm处测定OD值。H9c2细胞活力=(测定孔OD-对照孔OD)/对照孔OD×100%。实验平行重复3次。

1.2.5 流式细胞仪检测H9c2细胞凋亡 将H9c2细胞接种至6孔板，105个/孔。按上述方法建模转染后，收集各组细胞。用0.01 M PBS漂洗细胞，然后加入500 μl 1× binding buffer重悬细胞。接着加入Annexin-FITC和PI染色液各5 μl混匀，室温避光孵育10 min。使用BD Accuri C6流式细胞仪采集并分析数据。

1.2.6 Western blot检测凋亡相关蛋白 收集各组H9c2细胞，使用含有蛋白酶抑制剂Cocktail的RIPA裂解液冰上裂解细胞提取总蛋白，通过BCA法测定蛋白浓度，并将蛋白液95℃处理5 min变性。取50 μg蛋白样本行12% SDS-PAGE。湿法转印至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入Bcl-2、Bax、cleaved caspased-3和β-actin抗体4℃过夜。再加入二抗室温孵育1 h，用凝胶成像系统采集图像。

1.2.7 RT-PCR检测miR-760基因表达 收集处理后的心肌细胞，加入Trizol提取细胞总RNA。通过紫外可见分光光度计测定总RNA的纯度和浓度，A260/A280=1.8～2.0。通过Stem-loop RT-PCR方法检测miR-760表达量。以U6 snRNA为内参。RT反应使用Promega RT试剂盒、1 μg RNA组分进行。PCR条件：DNA于94℃预变性4 min，然后进行40次循环扩增：94℃变性40 s，52℃退火40 s，72℃延伸40 s。采用2-△△Ct法计算miR-760在H9c2细胞中的相对表达水平。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 miR-760在H/R后H9c2细胞中的表达及转染效果

H/R组H9c2细胞miR-760的相对表达量(0.451±0.033)较对照组(0.972±0.062)显著降低(P<0.001)。在转染48 h后，与H/R组相比，H/R+miR-760 mimics组H9c2细胞的miR-760相对表达量显著升高(0.683±0.031 比 0.451±.033，P<0.01)，H/R+miR-760 NC组H9c2细胞的miR-760相对表达量无显著差异(0.482±0.051比 0.451±0.033，P>0.05)。

2.2 miR-760对H/R后H9c2细胞活力的影响

与对照组比较，H/R组H9c2细胞活力明显降低(63.421±8.204比100.353±6.481，P<0.001)。与H/R组比较，H/R+miR-760 mimics组的H9c2细胞活力显著增加(79.412±7.301比63.421±8.204，P<0.01)。而H/R+miR-760 NC组与H/R组比较，H9c2细胞活力无显著差异(61.839±7.362比63.421±8.204，P>0.05)。

2.3 miR-760对H/R后H9c2细胞凋亡的影响

与对照组比较，H/R组H9c2细胞的凋亡率显著升高(47.903±8.572比6.325±1.391，P<0.001)。与H/R组比较，H/R+miR-760 mimics组H9c2细胞的凋亡率显著降低(20.525±7.765比47.903±8.572，P<0.01)。而H/R+miR-760 NC组的H9c2细胞凋亡率与H/R组比较无显著差异(47.322±7.329比47.903±8.572，P>0.05)，见图 1。

2.4 miR-760对H/R后H9c2细胞中Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3表达的影响

与对照组比较，H/R组H9c2细胞的Bcl-2表达量明显降低(0.161±0.033比0.293±0.033，P<0.001)；Bax和cleaved caspase-3表达量显著上调(0.343±0.017比0.123±0.021，0.561±0.033比0.094±0.008，P<0.001)。与H/R组比较，H/R+miR-760 mimics组H9c2细胞的Bcl-2表达量明显上调(0.287±0.053比0.161±0.033，P<0.001)；Bax和cleaved caspase-3表达量显著下降(0.157±0.012比0.343±0.017，0.263±0.033比0.561±0.033，P<0.001)，见图2。

图1 流式细胞术检测miR-760对H9c2细胞凋亡的影响

图2 Western blot检测miR-760对H9c2细胞Bcl-2、Bax和cleaved caspased-3表达的影响

3 讨论

miR-760参与多种疾病的发病过程，在多种病理条件下变化差异很大。口腔黏膜下纤维性变患者组织中miR-760表达量明显下调[8]，而在关节炎患者T细胞中miR-760表达量显著上调[9]。此外，miR-760还是预测多种癌症包括胃癌、乳腺癌、大肠癌、结肠癌和卵巢癌的生物标记物[10]。本研究发现，上调miR-760的表达能够抑制H/R引起的H9c2细胞凋亡，进而减轻H/R导致的心肌损伤。

凋亡是一种可以保障机体正常功能和代谢的程序性细胞死亡，其在心脏的发育中发挥着重要作用，并与很多心脏疾病相关，如缺血性心脏病、心脏再灌注损伤、化疗引起的心肌病和心力衰竭等[11]。虽然凋亡对维持正常成年人心脏的稳态必不可少，但在病理条件下，凋亡可能使心肌细胞丢失而导致危及生命的心功能失调。因此，调控凋亡是治疗心血管疾病的重要途径之一。与其他细胞相同，心肌细胞凋亡主要由死亡受体和线粒体通路激活引起。这两条通路均可激活起始Caspase(Caspase 8、9、10)，进而激活效应Caspase(Caspase 3)。Bcl-2家族蛋白是调节凋亡的重要因子，通过线粒体通路介导细胞色素C等物质的释放而导致细胞凋亡。本研究显示，miR-760通过上调Bcl-2、下调Bax和cleaved caspase-3蛋白的表达，可发挥抗心肌细胞凋亡的作用。

综上所述，miR-760在H/R后H9c2细胞中表达降低，上调miR-760的表达能减轻H/R导致的H9c2细胞凋亡，其机制可能与调节Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3蛋白的表达有关。这为以miR-760为靶点预防或治疗心肌细胞H/R损伤提供了新的依据和方向。近年来研究还发现，lnRNA、miRNA和mRNA之间存在相互调节关系，并在心肌细胞H/R损伤中扮演着重要角色。因此，miR-760上下游调控因子仍需进一步研究。

致谢

本工作在武汉大学中南医院心内科实验室完成，在此对胡笑容教授在实验材料、仪器设备及实验技术等方面给予的宝贵协助和指导致以衷心的感谢。

利益冲突：无