高脂喂食对自发性高血压大鼠动脉内皮功能的影响及鱼油的干预作用

王雷 王顺 孙书红 王文锋

710004 西安市第四医院心内科(王雷)；710061 西安交通大学医学院第一附属医院心内科(王顺)；710054 西安，武警陕西省总队医院心内科(孙书红)；726000 商洛市中心医院心内科(王文锋)

人类动脉硬化与高血压的发生发展密切相关，规范的健康教育指导下的合理饮食可有效改善患者的血压水平[1-2]。研究发现，长期鱼油干预可延缓易脑卒中型自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)左心室肥厚发展，减轻其小器官病理改变，但较少评估长期鱼油干预对大鼠的大动脉僵硬度及内皮功能的影响和具体机制。本实验长期给予SHR和Wistar-Kyoto(WKY)大鼠高脂饲料饮食，观察其鼠尾血压、动脉内皮功能、动脉僵硬度的变化，并用鱼油干预，观察其对这些变化的影响，为高血压的非药物治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物分组干预和血压测定

8周龄雄性SHR和WKY大鼠各30只，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供[合格证：SCXK(沪)2017-0005]，适应性喂养至14周龄，按完全随机分组法分为普食组(给予普食)、高脂组(给予高饱和脂肪酸，含基础饲料83%、蛋黄粉5%、猪油12%)和高脂加鱼油组(给予高脂鱼油，含基础饲料80%、蛋黄粉5%、猪油12%、鱼油3%，鱼油来自美国阿拉斯加深海鲑鱼油，每1 g含有180 mg二十碳五烯酸、120 mg二十二碳六烯酸和10 U维生素E)，喂养至36周[3]。使用大鼠尾压测量仪(BP-6A，成都泰盟)，测量安静状态下大鼠尾动脉收缩压，每2周测1次，每次3遍，取平均值。

1.2 动脉脉搏波传导速度(artery pulse wave velocity，APWV)测定

10%水合氯醛(0.5 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，四肢连接心电图，在大鼠腹前壁取A点和B点作为测量点，使用Philips IE33彩超仪显示升主动脉，测量A、B两点的距离(D)，记录A点、B点的TDI频谱，将心电图Q波开始至TDI频谱图S1峰开始的时间定为电-机械时间(electrical mechanical time，EMT)，分别测量A点和B点的电-机械时间(EMTa和EMTb)，并记录心率，脉搏波时间(pulse wave time，PWT)=EMTa-EMTb，APWV=D·PWT-1·心率-1。

1.3 血管内皮依赖性和非内皮依赖性舒张功能测定

大鼠胸主动脉取出后制成3～4 mm的血管环，由DMT压力换能器连于PowerLab生物信号采集系统，预处理后向浴槽内加入终浓度为1×10-6mol/L的苯肾上腺素(phenephrine，PHE)，使之达到收缩平台期后，顺序递增加入1×10-9mol/L、3×10-9mol/L、1×10-8mol/L、3×10-8mol/L、1×10-7mol/L、3×10-7mol/L、1×10-6mol/L、3×10-6mol/L、1×10-5mol/L、3×10-5mol/L、1×10-4mol/L的乙酰胆碱诱导内皮依赖性血管环舒张，同法测硝普钠(1×10-9mol/L～1×10-4mol/L)引起的非内皮依赖性舒张反应。舒张率=(PHE诱发的血管环张力-加入乙酰胆碱/硝普钠后的血管环张力)/PHE诱发的血管环张力×100%，乙酰胆碱和硝普钠1×10-4mol/L引起的舒张百分率为最大舒张率(percentage of maximal relaxation effect，Emax)。

1.4 内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)活性和含量测定

将保存血管制成10%的组织匀浆，按eNOS测试盒(Amresco，上海恒远生物公司)说明书逐步加样处理后酶标仪测定吸光度值，计算内皮细胞eNOS活性。按考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒(上海索桥生物)说明书逐步加样处理后酶标仪测定吸光度值，计算eNOS含量。

1.5 血浆一氧化氮含量测定

将冻存血浆缓慢溶解后取0.1 ml，逐步加样处理，充分混匀30 s，室温静置后离心10 min，取上清液加入显色剂混匀，室温静置10 min，使用NO含量测定试剂盒(上海研谨生物)处理样品，科华ST-960酶标仪测定吸光度值，血浆一氧化氮含量(μmol)=[(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)]×标准品浓度×样品测试前稀释倍数。

1.6 反转录聚合酶链反应检测动脉内皮细胞eNOS mRNA表达

引物序列：eNOS上游：5’- CCAGGCTCTCACTTACTTCC -3’；下游：5’- GAACCACTTCCATTCTTCGTAG-3’；产物151 bp；甘油醛-3-磷酸脱氢酶( glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase )上游：5’-ATGGTGAAGG TCGGTGTGAACG-3’；下游：5’-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG-3’；产物233 bp，由北京三博远志生物技术有限公司合成。使用PCR仪(IQ5.0 Biorad美国)进行实时荧光定量检测。获取每个样品eNOS mRNA、GAPDH的CT值，计算其CT值差值及比值，以比值作为目的片段的相对含量，结果的分析采用2-ΔΔCt法，即ΔΔCt=对照组ΔCt-各组ΔCt 。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 鱼油对大鼠血压的影响

实验末期，WKY大鼠普食组死亡3只，高脂组死亡2只。大鼠收缩压在6组间和12个时间点间比较，差异有统计学意义(均为P<0.01)。分组和时间之间有交互作用(MS=303.063，F=5.979，P<0.01)。即随时间增加，SHR普食组血压略微上升，高脂组明显上升，高脂加鱼油组呈现明显下降趋势，而WKY大鼠三种喂养方式下收缩压变化趋势不明显(图1)。

与SHR普食组比较，aP<0.05；与SHR高脂组比较，bP<0.05图1 SHR和WKY大鼠不同饮食干预下鼠尾血压的变化

SHR大鼠14周龄时高血压模型已完全形成，随着周龄的增加，普食组收缩压基本稳定在较高水平，高脂组血压有逐渐升高的趋势，20周时高脂组与普食组血压出现统计学差异(P=0.025)越往后差异越明显。在添加富含n-3多不饱和脂肪酸鱼油的高脂饮食下(高脂加鱼油组)未见血压逐渐升高，而是稳定在较普食组低的水平(P=0.028)。

2.2 鱼油对高脂喂养大鼠APWV的影响

喂养至36周龄，整体比较各组间APWV差异有统计学意义，SHR高脂组较SHR普食组升高[(16.7±2.0) ms比(10.4±3.1) ms，P<0.05]， SHR高脂加鱼油组较SHR高脂组降低[(9.4±2.1) ms比(16.7±2.0) ms，P<0.05]。WKY大鼠3组间APWV比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 鱼油对内皮依赖性动脉舒张功能的影响

SHR大鼠3种饮食干预下的血管舒张率在11种梯度浓度下比较有明显差异(P<0.05)，饮食干预和乙酰胆碱浓度的交互作用无统计学意义(P=0.68)。组间比较，SHR高脂组浓度梯度乙酰胆碱作用下内皮依赖性血管舒张率较普食组降低，SHR高脂加鱼油组较高脂组升高(均为P<0.05)。WKY大鼠3种饮食干预下的血管舒张率在11种梯度浓度乙酰胆碱作用下整体比较差异有统计学意义(P<0.05)，饮食干预和乙酰胆碱浓度的交互作用无统计学意义(P=0.16)。组间比较，WKY大鼠高脂加鱼油组大于高脂组(P<0.01)。各组间最大内皮依赖性血管舒张率有明显差异(P<0.05)，两两比较，SHR高脂组较普食组明显降低(51.61%±4.18%比55.75%±3.56%，P<0.05)，SHR高脂加鱼油组较高脂组明显升高(59.34%±3.75%比51.61%±10.18%，P<0.05)。WKY大鼠高脂组较普食组明显降低(49.00%±1.95%比60.06%±3.66%，P<0.05)，高脂加鱼油组较高脂组明显升高(66.13%±1.45%比49.00%±1.95%，P<0.05)(图2)。

与普食组比较，aP<0.05；与高脂组比较，bP<0.05图2 鱼油对高脂喂养大鼠动脉环对梯度浓度乙酰胆碱的舒张反应

2.4 鱼油对非内皮依赖性动脉舒张功能的影响

各组间硝普钠引起的非内皮依赖性最大血管舒张率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，(图3)。

2.5 鱼油对高脂喂养大鼠动脉eNOS mRNA表达、eNOS活性及一氧化氮含量的影响

动脉eNOS mRNA、eNOS活性及一氧化氮含量在SHR高脂组低于普食组，高脂加鱼油组高于高脂组(均为P<0.05)；WKY高脂组低于普食组，高脂加鱼油组高于高脂组(均为P<0.05)(表1)。

3 讨论

本研究通过对SHR及WKY长达22周的喂食干预，SHR高脂组血压较SHR普食组持续升高，但程度趋于平稳，高脂加鱼油喂养组血压无明显上升趋势，表明高饱和脂肪酸使SHR动脉内皮细胞eNOS mRNA表达水平和eNOS活性降低，血浆一氧化氮含量降低，血管内皮依赖性舒张功能减退，弹性功能减弱，动脉僵硬度增加，鼠尾血压增高，提示高饱和脂肪酸喂食改变大动脉内皮功能是影响SHR大动脉僵硬度的途径之一。含鱼油的高脂饮食逆转了上述作用，表明富含n-3多不饱和脂肪酸鱼油是抑制高饱和脂肪酸饮食引起的血压升高和进展的可能机制之一。由此推测，当伴有肥胖或超重的高血压患者血压水平单用降压药治疗很难控制时，脂肪酸成分膳食的不均衡可能是其原因之一，而健康膳食、减重、改善脂质代谢等可提高这些患者的治疗效果。无高血压遗传因素的WKY大鼠血管内皮依赖性舒张功能未受到影响，表明高饱和脂肪酸喂养对血压的影响依赖于遗传因素。

高血压患者多伴有不良的膳食习惯及脂质代谢紊乱，导致大动脉内皮依赖性血管舒张功能障碍和中心动脉僵硬度增高。本课题组前期临床试验中测定中青年高血压患者和健康对照者小动脉弹性指数，随访2年后再次测定两组的小动脉弹性指数，发现中青年高血压患者小动脉弹性指数下降程度显著增加，与其空腹血游离脂肪酸组成异常(饱和脂肪酸水平增高、n-3多不饱和脂肪酸水平降低)相关；短期(8周)补充富含n-3多不饱和脂肪酸的鱼油对超重高血压患者的动脉弹性有改善作用。

循环中高浓度游离脂肪酸的升压作用及鱼油的降压作用已得到多个研究证实，但其具体机制尚不清楚。有研究认为，游离脂肪酸可能增加血管α1肾上腺受体的反应性或交感神经系统活性[5-6]；通过蛋白激酶C依赖性机制诱导血管平滑肌细胞的增殖、迁移[7]；改变膜的转运，使血管平滑肌细胞钙离子通道密度增高及膜通道的动力学发生变化；增加血管紧张素Ⅱ的水平和恶化氧化应激反应等[8]。而相关研究报道鱼油降压机制也各不相同，有研究认为，高血压大鼠DHA降压作用的机制可能是降低了血管对去甲肾上腺素的反应性，或通过减少肾上腺的醛固酮合成，使肾素血管紧张素醛固酮系统功能降低，亦有研究认为鱼油降低血压很大程度上是因其改变了花生四烯酸的代谢。目前有报道表明，n-3多不饱和脂肪酸通过CYP1A1激活eNOS，调节一氧化氮活性发挥控制血压的作用，也有发现认为n-3多不饱和脂肪酸通过抑制鞘磷脂介导血管平滑肌收缩发挥降压的作用[9-10]。本研究的发现解释了n-3多不饱和脂肪酸具有较强的激活eNOS和调节一氧化氮生物活性的作用，从而减低了主动脉管壁僵硬度，发挥了一定的降压作用。

图3 鱼油对高脂喂养大鼠动脉非内皮依赖性舒张功能的影响

表1 鱼油对高脂喂养大鼠血浆一氧化氮含量、动脉eNOS mRNA表达及eNOS活性的影响

注：eNOS：内皮型一氧化氮合酶；与SHR高脂组比较，aP<0.05；与WKY高脂组比较，bP<0.05

膳食中各种脂肪酸的摄入量对动脉僵硬度影响的研究较少，本研究中发现富含EPA/DHA的鱼油可有效逆转高脂喂食引起的血液生化改变及动脉僵硬度增加，结合文献推测其可能的机制：(1)鱼油从基因水平提高了eNOS的表达，升高血管内皮细胞内eNOS活性，导致血中一氧化氮含量增高，使血管内皮功能得到有效改善；(2)鱼油本身具有抗氧化应激反应作用，打破内皮-一氧化氮氧化应激链[11-12]，保护了血管内皮细胞完整性。

本研究还证实了高脂喂食可减弱乙酰胆碱介导的动脉内皮依赖性舒张功能，而不减弱硝普钠介导的非内皮依赖性舒张功能，表明鱼油是通过改善血管内皮功能，促进内皮细胞释放一氧化氮，调节一氧化氮-去甲肾上腺素的相互作用参与了降压过程，它不但能降低血压增高的趋势，而且能改善内皮功能。脂肪酸家族中，PUFA中的DHA和EPA具有保护血管内皮功能及结构完整性的作用，而油酸、软脂酸、硬脂酸等可能损害了血管内皮功能及结构的完整性。不同的脂肪酸之间也可以相互作用，如饱和脂肪酸在相应去饱和酶的催化下可以转化为不饱和脂肪酸及其衍生物，如何促进这种有利的转化可能是我们今后研究的思路。

利益冲突：无