三阴性乳腺癌细胞EMT 过程对其生物学特性的影响

朱超，杨晨，冯琛，钱军

（1.蚌埠医学院第一附属医院 肿瘤外科，安徽 蚌埠 233000；2.蚌埠医学院第一附属医院 肿瘤内科，安徽 蚌埠 233000）

0 引言

乳腺癌为临床常见恶性肿瘤，为女性癌症中发病率和死亡率均较高的疾病。临床上通常将乳腺癌分为两种亚型：三阴性乳腺癌、非三阴性乳腺癌。三阴性乳腺癌的临床治疗手段有限，短期内容易复发转移，其复发和转移的生物学机制为学者们研究的热点[1]。目前得到证实的是，肿瘤细胞上皮间充质转化（Epithelial mesenchymal transformation，EMT）参与了多种恶性肿瘤复发和转移的发生发展过程[2]。因此对于三阴性乳腺癌的EMT 过程及生物学机制的相关研究具有重要的意义。本研究对三阴性乳腺癌细胞的EMT 过程及其生物学特征进行了分析。

1 材料和方法

1.1 细胞株、试剂、仪器

（1）乳腺癌细胞株：人三阴性乳腺癌细胞株BT-549、人非三阴性乳腺癌细胞株MCF-7 均购于中国科学院细胞库。BT-549、MCF-7 分别用L-15、DMEM 培养基（含10%胎牛血清），在5%二氧化碳，37℃的培养箱中培养，2-3 天后传代1 次，取对数生长期的细胞用于本次研究。

（2）主要试剂和仪器，主要试剂：L-15、DMEM培养基（美国Hyclone 公司），胎牛血清（杭州四季青试剂公司），青链双抗混悬液（北京索莱宝公司），胰蛋白酶（美国Sigma 公司）、细胞波形蛋白（Vinmentin）、上皮细胞钙粘蛋白（E-cadherin）、间质细胞钙粘蛋白（N-cadherin）一抗、二抗（美国Cell Signaling Technology 公司）、DAB 试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

主要仪器：洁净工作台（苏州空气技术有限公司，BCM-100A 型），二氧化碳培养箱、微生物培养箱、恒温水浴箱（天津泰斯特仪器有限公司），倒置显微镜（德国Leica 公司），凝胶成像仪（美国 BIORAD，Gel Doc XR），Western 电泳仪（美国 BIORAD，164-5051），Trans-Blot Turbo 全能型蛋白转印系统（美国 Bio-rad 170-4150）

1.2 方法

（1）Western Blotting 检测蛋白表达：总蛋白的提取→BCA 法蛋白浓度的测定→SDS—PAGE 电泳→转膜→封闭、抗原抗体反应→显色

（2）平板克隆细胞增殖实验：细胞消化、计数、配制成细胞悬液（浓度1×103个/mL），加入6 孔细胞培养板中，培养箱中培养2 周（37℃，5%CO2），当达到满意克隆数时终止培养。磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞，甲醇固定，染色，计数。

（3）Transwell 细胞侵袭转移实验：无血清培养基包被Transwell 小室底部膜上室面，4℃风干，加入无血清培养基，37℃培养30 分钟。终止消化，PBS 清洗，重悬。调整细胞密度至1-5×105个/mL。Transwell 小室中加入细胞悬液，置于24 孔培养板中，加入培养基，培养12 h，接种1 h 后，0.1%伊红染色。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用（）表示，两样本均数比较采用独立样本t检验。计数资料采用例数或百分比表示。假设检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 两组细胞EMT 相关蛋白表达水平比较

我们通过Western Blotting 检测两组细胞EMT 相关基因蛋白（上皮表型的标志分子E-cadherin，间质表型的标志分子N-cadherin、Vimentin）表达水平的差异。结果显示，三阴性乳腺癌细胞上皮表型的标志分子E-cadherin 表达低于非三阴性乳腺癌细胞，而其间质表型的标志分子N-cadherin、Vimentin 表达高于非三阴性乳腺癌细胞（见图1）。

图1 两组细胞EMT 相关基因蛋白表达水平的差异

2.2 三阴性和非三阴性乳腺癌细胞增殖能力比较

统计结果显示，三阴性乳腺癌细胞的克隆形成率明显多于非三阴性乳腺癌细胞，差异均有统计学意义（P＜0.01），见表1，图2。

表1 两组细胞克隆率比较（）

表1 两组细胞克隆率比较（）

图2 两组细胞克隆形成图

2.3 三阴性和非三阴性乳腺癌细胞侵袭及转移能力比较

统计结果显示，三阴性乳腺癌细胞的侵袭细胞数目、转移细胞数目均明显多于非三阴性乳腺癌细胞，差异均有统计学意义（P＜0.01），见表2，图3。

表2 两组侵袭细胞数目及转移细胞数目比较（）

表2 两组侵袭细胞数目及转移细胞数目比较（）

图3 两组乳腺癌细胞侵袭及转移细胞数目

3 讨论

EMT 是细胞骨架重组，上皮细胞转变为间质细胞表型的过程，因间质细胞具有明显的迁移能力，因此推测EMT 的发生对于肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力具有积极的促进作用[3]。SBEM 为一种分泌性蛋白，有研究发现，SBEM 能够通过EMT 促进三阴性乳腺癌的侵袭和转移[4]。E-cadherin 的表达与三阴性乳腺癌肿瘤大小、组织学分级和淋巴结转移呈负相关[5]。Vimentin 是EMT 重要的间质表型标志分子，其高表达提示乳腺癌预后不良[6]。本研究中比较了三阴性乳腺癌组织及非三阴性乳腺癌组织的EMT 相关蛋白的表达，统计结果显示，三阴性乳腺癌组织的N-cadherin 蛋白、Vinmentin 蛋白的阳性表达率均明显高于非三阴性乳腺癌组织，E-cadherin 蛋白的阳性表达率明显低于非三阴性乳腺癌组织。说明三阴性乳腺癌细胞EMT 程度要高于非三阴性乳腺癌细胞。

为了进一步分析两种亚型的乳腺癌细胞的增殖及侵袭能力，本研究采用平板克隆实验及Transwell细胞侵袭及转移实验进行了相关的分析。结果显示，三阴性乳腺癌细胞的克隆形成率及侵袭细胞数目、转移细胞数目均明显多于非三阴性乳腺癌细胞，证实了三阴性乳腺癌细胞的高增殖和侵袭能力，这与其高EMT 程度相关。