IVM培养液中添加半胱胺、胱氨酸改善人卵母细胞胚胎发育潜能的研究

李青，赵海滨，张传鑫，马水英，李梅，吴克良

(山东大学附属生殖医院，济南 250021)

人未成熟卵母细胞体外成熟(in-vitro maturation，IVM)技术是指从不孕患者体内获得的未成熟卵母细胞，通过模拟体内卵母细胞的成熟环境，使卵母细胞恢复减数分裂，完成成熟并且具有受精和发育到胚胎阶段潜能的技术。IVM技术虽然很早运用于临床治疗，但是体外培养的卵母细胞成熟水平和受精后的胚胎发育能力都低于体内成熟的卵母细胞[1]，如何获得较好的发育潜能是IVM领域研究的热点。卵母细胞成熟包括细胞核成熟和细胞质成熟两个过程，只有二者都成熟的卵母细胞才能获得较好的受精和胚胎发育能力。影响IVM的因素很多，主要包括体外培养时间、活性氧、O2浓度[2]、光照、温度、pH和培养液成分[3-4]。活性氧的变化是影响卵母细胞胚胎发育的主要因素，适量的活性氧可以诱导卵母细胞成熟，但是过量的活性氧会引起氧化损伤。在哺乳动物卵母细胞内具有一定的抗氧化机制，可以清除卵母细胞内累积的活性氧，在卵母细胞成熟过程中，卵丘细胞、卵泡液和输卵管液能够保护卵母细胞免受氧化损伤。由于缺乏正常发育的条件，体外培养的卵母细胞存在细胞受损或停止发育的现象。

谷胱甘肽是一种重要的巯基还原物质，能够保护细胞免受氧化损伤，卵母细胞胞质中还原型谷胱甘肽水平能有效反映卵母细胞的成熟质量[5]。有研究表明，卵母细胞IVM培养时，细胞核成熟快于细胞质成熟，并且IVM的卵母细胞内谷胱甘肽浓度低于体内成熟的卵母细胞[6]。卵母细胞内高还原型谷胱甘肽水平有助于卵母细胞核、细胞质发育的同步化。半胱胺是重要的抗氧化物质，能够保护卵母细胞免受氧化损伤从而明显提高受精后的胚胎发育潜能[7]。胱氨酸是谷胱甘肽的合成底物。大量动物实验研究表明，在卵母细胞IVM过程中添加半胱胺或(和)胱氨酸能促进细胞内谷胱甘肽合成，进而提高胚胎的发育水平[8-9]。我们在前期山羊[10]和小鼠[11]研究中发现，IVM培养液中加入半胱胺和胱氨酸能够明显提高胚胎的发育潜能，且最佳浓度的半胱胺(100 μmol/L)和胱氨酸(200 μmol/L)使囊胚发育率最高。

在人卵母细胞IVM过程中，许多研究集中在向培养液中添加各种物质以提高卵母细胞的IVM和胚胎发育潜能，但结果表明未成熟卵母细胞经IVM、体外受精和胚胎培养后很少能发育至囊胚阶段[12]。本研究首次在人卵母细胞IVM培养液中加入半胱胺和胱氨酸，观察半胱胺和胱氨酸在未成熟卵母细胞体外培养中的作用，希望提高卵母细胞的成熟质量，以获得较高的胚胎发育潜能，进而优化IVM培养体系，为不孕患者提供更多的妊娠机会。

资料与方法

一、研究对象

收集2017年1月至 2018年12月在山东大学附属生殖医院就诊并行卵胞浆内单精子注射-胚胎移植(ICSI-ET)患者的未成熟卵母细胞。纳入标准：患者无吸烟、酗酒、吸毒等不良嗜好，年龄在20～38岁；取卵数大于6枚，且未成熟卵母细胞数/获卵数的比例小于30%；不育因素为单纯男方因素或同时合并女方输卵管因素。排除艾滋病、梅毒、乙型肝炎抗阳性患者。女方经超促排卵HCG 36～38 h后在超声引导下穿刺取卵。取卵后2～5 h 用透明质酸酶消化去除黏液团和颗粒细胞，将未成熟的 GV 期和 MⅠ期的卵母细胞用于本研究。ICSI注射所用精子来源于供精，由山东省精子库提供。

本研究的开展获得本医院伦理委员会的批准，所有患者均签署知情同意书。

二、方法

1. IVM培养液的配制：IVM培养液需要提前一天配制，在TCM-199(sigma，美国)中加入10%人血清白蛋白(vitrolife，瑞典)、0.29 mmol/L丙酮酸钠(sigma，美国)、50 U/ml青霉素、50 U/ml链霉素，置于37℃、6%CO2的培养箱中平衡过夜；第2天收集未成熟卵母细胞前4 h左右在培养液中依次加入10 ng/ml EGF(sigma，美国)、75 U/L FSH(serono，瑞士)、150 U/L HCG(serono，瑞士)。

半胱胺(sigma，美国)配制成20 mmol/L的储存液，胱氨酸(sigma，美国)配制成50 mmol/L的储存液，分装后于-20℃冰箱保存，使用前用IVM培养液稀释到所需浓度。

2. 未成熟卵母细胞的获得：收集患者的卵母细胞，在37℃、6%CO2的培养箱中培养 2～5 h 后，用透明质酸酶消化掉卵母细胞周围的黏液团和颗粒细胞，判断卵母细胞成熟情况，成熟卵母细胞用于正常的ICSI治疗。收集经确认后的未成熟卵母细胞，包括减数分裂Ⅰ(metaphase Ⅰ，MⅠ)期和有生发泡(germinal vesicle，GV)期的卵母细胞，将其随机分为添加组和不添加组，添加组的卵母细胞培养时需在IVM培养液中添加100 μmol/L半胱胺和200 μmol/L胱氨酸；不添加组的卵母细胞培养时，单纯使用IVM培养液。所有未成熟卵母细胞均过夜培养，24～28 h 后观察卵母细胞成熟情况，以可见第一极体为卵母细胞成熟的标志。

3. 体外培养成熟后ICSI和胚胎培养：成熟卵母细胞用供精行ICSI，18～20 h后观察卵母细胞受精情况，出现2个原核为正常受精(2PN)。卵裂率为正常受精卵分裂的比例。胚胎培养至第3天(D3)，卵裂球为7～10个细胞或者融合胚，碎片小于30%为D3优胚；胚胎发育至D5、D6进行囊胚评估[13]，评分为4BC及以上者为优质囊胚[14]。2PN分裂为优质胚胎的比例为优胚率。

三、统计学分析

采用SPSS 17.0软件包对实验数据进行，数据比较采用χ2检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

一、一般资料

共收集超促排卵周期中未成熟卵母细胞584枚，其中MⅠ期卵母细胞278枚，添加组141枚，不添加组137 枚；GV期卵母细胞306枚，添加组158枚，不添加组 148枚。

二、半胱胺和胱氨酸对GV期卵母细胞IVM及发育的影响

GV期卵母细胞IVM培养后，添加组卵母细胞成熟率为67.1%，不添加组卵母细胞成熟率为57.4%，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。添加组D3优胚率(46.7%)和优质囊胚形成率(26.7%)均显著高于不添加组(分别为22.6%、9.7%)(P<0.05)；两组的受精率和卵裂率比较差异均无统计学意义(P>0.05)(表1)。

三、半胱胺和胱氨酸对MⅠ期卵母细胞IVM及发育的影响

MⅠ期卵母细胞经IVM培养后，添加组卵母细胞的D3优胚率(55.4% vs. 28.4%)和优质囊胚形成率(25.7% vs. 9.5%)均显著高于不添加组(P<0.05)；但两组的成熟率、受精率和卵裂率比较差异均无统计学意义(P>0.05)(表2)。

表1 半胱胺和胱氨酸对GV期卵母细胞IVM及发育的影响(%)

表2 半胱胺和胱氨酸对MⅠ期卵母细胞IVM及发育的影响(%)

讨 论

随着人类生育年龄的推迟和二胎政策的放开，女性生育要求日趋强烈，但是不孕症、卵巢储备功能不足、卵泡发育迟缓等女性生殖疾病的发生率也呈逐年上升趋势，许多不孕不育患者选择人类辅助生殖技术繁衍后代。IVM 技术不仅能充分利用常规IVF和ICSI技术中的未成熟卵母细胞、提高卵母细胞利用率，且能减少卵巢过度刺激综合征(OHSS)的发生，是治疗多囊卵巢综合征(PCOS)性不孕症的有效方法[15]，为赠卵及女性生育力保存提供了更多选择，具有很好的发展前景[16-17]。 IVM 作为新的助孕技术，目前在临床和实验室研究方面取得了一定的进展。IVM能够充分利用IVF/ICSI中约15%的未成熟卵母细胞，提高了累积妊娠率和抱婴率。对PCOS患者，IVM可以降低促排卵药物的使用，避免 OHSS的发生。对于年轻尚未生育的肿瘤患者，IVM联合IVF-ET能够保存生育力，使其实现生育梦想。但IVM仍面临成熟率、受精率、优质胚胎率及妊娠率低等问题[18]。

与体内成熟的卵母细胞相比，IVM的卵母细胞由于缺乏体内成熟的条件，核成熟和细胞质成熟不同步，从而影响卵母细胞的质量，所以目前IVM 培养液培养的卵母细胞，其胚胎种植率、临床妊娠率、活产率均显著低于成熟卵新鲜ICSI 周期。影响IVM的因素很多，常见的有：(1)培养时间：适当延长 IVM 时间可提高未成熟卵母细胞的细胞成熟率。(2)激素的添加：促性腺激素在卵泡发育中发挥重要作用，可刺激卵母细胞的成熟，有大量研究在IVM培养液中加入FSH[19]、LH、HCG或E2[20]等。(3)抗氧化剂的添加：IVM过程中卵母细胞容易发生氧化应激，从而导致体外成熟障碍，在卵母细胞IVM培养体系中添加某些抗氧化物质[21]可以提高培养效率。目前动物研究中常通过在IVM培养基中加入褪黑激素、谷氨酰胺、白藜芦醇、肌醇、E-64、抗坏血酸和生育酚等以降低卵母细胞内活性氧水平[22-23]，从而降低氧化应激对卵母细胞的损害，但是在人卵母细胞IVM培养液中的相关研究则较少。

在本实验中，我们在人卵母细胞IVM培养液中加入了100 μmol/L半胱胺和200 μmol/L胱氨酸，研究了半胱胺和胱氨酸对人未成熟卵母细胞IVM、受精和胚胎发育的影响。结果表明，无论对于GV期还是MI期卵母细胞，半胱胺和胱氨酸均能显著提高D3优胚率和优质囊胚形成率，这与我们前期研究[10-11]得出的结论相符。可能的原因为IVM培养液中添加的半胱胺和胱氨酸提高了未成熟卵母细胞中的谷胱甘肽(GSH)水平，改善了卵母细胞的细胞质量，从而提高了胚胎的发育能力。

综上，本研究的结果为进一步优化体外培养系统提供了重要线索，提高了常规IVF-ET周期未成熟卵母细胞的胚胎发育潜能，具有一定的临床应用价值。但是对于半胱胺和胱氨酸提高胚胎发育潜能的机理仍有待于进一步的研究。