孕期高雄激素对子代大鼠卵巢颗粒细胞P450芳香化酶表达的影响

邢彦，刘海宁

(青岛市市立医院生殖医学科，青岛 266000)

多囊卵巢综合征(PCOS)是一种多起因的女性内分泌系统疾病，典型的特征是高雄激素血症、排卵障碍和卵巢多囊样改变，但确切的病因很复杂，并不十分明确。Barker[1]提出了“成人疾病的胎儿起源假说”，认为生命早期在关键和敏感的时期受到刺激和损伤会导致遗传重新编码，从而导致生理和代谢的长期改变。最近的研究证明，胎儿暴露于宫内高雄激素环境，会导致子代成年后出现PCOS样的特征[2]。而卵巢来源的高雄激素是PCOS内分泌紊乱的一个主要表现，有学者认为是卵巢局部过高的雄激素阻断了卵泡向优势卵泡阶段的发育[3]，从而导致PCOS的各种临床表现。卵巢颗粒细胞P450芳香化酶(P450aroma)是将雄激素转化为雌激素的关键酶，有研究表明P450aroma mRNA在PCOS大鼠卵巢组织中的表达明显低于对照组，并推测PCOS的发生可能与P450aroma的降低有关[4]。故本研究建立妊娠晚期暴露于高雄激素环境的大鼠动物模型，检测子代雌鼠卵巢组织P450aroma的表达，从而探讨PCOS的早期病因。

材料和方法

一、材料

1.研究对象：选用性成熟雌性Wistar大鼠20只，体重200～220 g，随机分成实验组和对照组，每组各10只。按照1∶1比例与雄性Wistar大鼠合笼交配，次日行阴道涂片，找到精子记为妊娠第0天。在妊娠第15～20 d，实验组大鼠颈部皮下注射丙酸睾丸酮注射液0.6 mg，每日1次；对照组大鼠颈部皮下注射中性茶树油0.6 mg，每日1次。待其自然分娩，留取其子代雌鼠继续饲养至2月龄性成熟期处死，留取卵巢组织。

2.主要试剂：PV6002试剂(北京中山金桥)；P450aroma兔抗鼠多克隆抗体(北京博奥森生物)；RNA fast200总RNA提取试剂盒(上海飞捷生物)；第一链合成试剂盒、HSTMTaq Mix、100 bp DNA ladder、琼脂糖(北京东盛生物)；PCR引物(上海生物工程)。

3.主要仪器：双目显微镜(Olympus，日本)；超净工作台(北京半导体设备一厂)；高速离心机(GS-15R，Beckman，美国)；分光光度计(273BRO106，Bio-Rad，美国)；超低温冰箱(SANYO，日本)；PCR扩增仪(T1 ThermocycIer，Bionetra，德国)；水平电泳仪(DYY-Ⅲ，北京六一仪器厂)；凝胶成像系统(Bio-Rad，美国)。

二、方法

1. 取材：实验组和对照组分别产下雌性大鼠35只和44只。于子代雌鼠2月龄性成熟时，行4%水合氯醛腹腔麻醉(0.3 ml/100 g)后，取双侧卵巢组织。一侧卵巢组织置于4%多聚甲醛液中固定24 h用于免疫组化检测；另一侧卵巢组织置于DEPC水处理过的EP管中，并放入-70℃冰箱保存用于RT-PCR检测。

2. 免疫组织化学检测P450aroma蛋白表达：运用常规免疫组织化学PV6002二步法。卵巢组织经4%多聚甲醛固定24 h后组织切片，经烤片、常规脱蜡脱水、水化后，滴加一抗P450aroma兔抗鼠多克隆抗体(1∶200 PBS液稀释)，4℃冰箱过夜；PBS液冲洗4次，各1.5 min；除去PBS，滴加新鲜配制的DAB工作液(A、B、C三种液体各50 μl，加入850 μl蒸馏水，混匀)，自来水充分冲洗，苏木素复染5 min，1%盐酸酒精分化30 s，氨水返蓝10 min，自来水充分冲洗，烤干。以PBS代替P450aroma一抗作为阴性对照。

镜下观察以卵巢颗粒细胞胞浆内出现黄色细颗粒为P450aroma表达阳性。结果判断标准参照Fromowitz阳性细胞半定量分级法：随机观察5个高倍视野，每个视野计数100个细胞。先根据阳性细胞数所占的百分数计分：<5%计0分，5%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，>75%计4分；再根据阳性细胞染色强度计分：无着色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。最后根据两者相加所得总分判定结果：0～1分(-)，2～3分(+)，4～5分(++)，6～7分(+++) 。

3. RT-PCR检测P450aroma mRNA表达：总RNA的提取以及mRNA逆转录成cDNA(第一链的合成)采用试剂盒，严格按照说明书操作。PCR采用10 μl反应体系：cDNA 1.2 μl、Primer1 0.4 μl、Primer2 0.4 μl、HSTMTaq Mix 5 μl、超纯水3 μl。PCR循环参数：94℃充分变性5 min；94℃变性30 s、50℃退火30 s、72℃延伸1 min，39个循环；72℃充分延伸10 min。PCR产物行1.2%琼脂糖凝胶电泳(120 V，30 min)，EB染色20 min，在长波紫外灯下观察，凝胶成像系统照相。用Quantity one软件分析电泳条带进行光密度扫描，以P450aroma与内参照β-actin电泳条带DNA含量值之比作为评价P450aroma基因mRNA的相对表达量。PCR引物使用Primer Premier5.0软件设计，由上海生工生物有限公司合成(表1)。

表1 RT-PCR引物序列及产物大小

三、统计分析

采用SPSS 19.0软件。计数资料比较采用χ2检验，计量资料比较采用独立样本t检验；以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、免疫组化检测结果

P450aroma蛋白在窦状卵泡颗粒细胞、黄体和卵巢间质中均有表达。比较卵泡颗粒细胞胞浆内P450aroma蛋白的表达发现，实验组P450aroma蛋白表达显著低于对照组(P<0.05)(表2，图1)。

表2 P450aroma蛋白在子鼠成熟卵泡颗粒细胞中的表达

A：实验组；B：对照组图1 P450aroma蛋白在子鼠成熟卵泡颗粒细胞中的表达(免疫组化PV6002法，苏木素复染，×100)

二、RT-PCR结果

实验组与对照组卵泡颗粒细胞中P450aroma mRNA的相对表达量分别为(0.217 7±0.008 3)和(0.413 2±0.010 3)，实验组P450aroma mRNA的相对表达量显著低于对照组(P<0.05)(表3，图2)。

表3 P450aroma mRNA在两组子鼠卵巢组织中的相对表达量比较(-±s)

M：100 bp DNA marker； 1.实验组P450aroma； 2.实验组β-actin； 3.对照组P450aroma； 4.对照组β-actin； 5.空白对照图2 RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳图

讨 论

大鼠为晚成雏哺乳动物，在出生前后内生殖器和神经系统对雄激素反应敏感，故我们选择在妊娠晚期给大鼠皮下注射丙酸睾丸酮[5]，建立宫内高雄激素环境的动物模型，研究对子代雌鼠的影响。在前期的研究中我们发现，宫内暴露于高雄激素环境的子鼠，其表观遗传学发生了一些改变，包括出生体重低于对照组、出生后100 d体重高于对照组、出生后100 d乳房数低于对照组。我们的数据还发现宫内暴露于高雄激素环境的子鼠脐带血睾酮浓度高于对照组，且成年后动情周期明显少于对照组[6]。

在很多情况下，PCOS的发病具有明显的遗传特征，但是目前为止，对于PCOS的相关基因研究还未取得明确进展[7]。目前最流行的假说是宫内发育胎儿过度暴露于雄激素环境可导致表观遗传改变，尤其是女性胎儿期暴露于高雄激素环境，可影响胎儿相关靶基因表达，主要与卵巢甾体激素、胰岛素的合成及GnRH脉冲分泌有关[8]，与PCOS的发生关系紧密，成年后可表现为稀发/无排卵、高雄激素血症、卵巢多囊样改变以及胰岛素抵抗。卵巢来源的高雄激素血症是PCOS的主要表现之一，Harada等[9]认为卵巢颗粒细胞中P450aroma的缺陷与高雄激素血症有关，芳香化酶调控机制的改变是引起PCOS的原因。

细胞色素P450aroma是CYP19基因的产物，是将雄激素转化为雌激素的限速酶。芳香化酶的表达与胎儿性腺的发育、卵泡的发育密切相关[10]。近年来已有动物实验证实PCOS患者卵巢组织中P450aroma的表达异常，可能是卵巢激素分泌紊乱，干扰卵巢正常排卵的原因，表现为P450aroma合成减少导致雄激素增高[11]。在正常情况下，雄激素是FSH诱导的芳香化酶的底物，低浓度的雄激素可以增强芳香化酶的活性，促进雄激素转化为雌激素。当卵泡中雄激素水平过高时，则是促进雄激素向活性更高的5α-还原型雄激素-双氢睾酮转化，可刺激小卵泡生长，阻断卵泡向优势卵泡阶段发育成熟，从而形成卵巢多囊样改变[12]。而已有实验表明PCOS患者血清和羊水中睾酮浓度明显高于对照组[13]。本实验通过检测孕期高雄激素环境下实验组子代雌鼠与对照组子代雌鼠卵巢P450aroma的mRNA表达和蛋白表达，发现两者在基因水平和蛋白水平均是实验组显著低于对照组(P<0.05)。进一步证明在卵巢发育和卵母细胞发生早期阶段暴露于高雄激素环境，会导致子代雌鼠卵巢芳香化酶表达和合成下降，雄激素升高，进而推测是PCOS相关生殖紊乱的原因之一。还有研究表明，宫内暴露于高雄激素环境的雌性后代可能发生非常罕见的P450aroma基因突变导致功能丧失，从而出现高雄激素血症和卵巢多囊样改变的表现[14]。

另外，胎儿某一敏感时期暴露于高雄激素环境干扰了下丘脑的Kiss1系统，Kisspeptin是由KISS1基因编码、下丘脑分泌的多肽，是一种作用于GnRH上游的新发现的神经调质，对类固醇激素的反馈调节和代谢反应敏感[15]。GnRH脉冲频率增加，引起LH分泌增加、FSH分泌减少，而正常卵巢颗粒细胞内芳香化酶是FSH诱导的，进而导致颗粒细胞内P450aroma活性受限，雄激素向雌激素转化受限，雄激素水平增高，出现PCOS样临床表现[16]。

PCOS发病机制复杂，至今尚未明确。本实验发现宫内暴露于高雄激素环境的子代雌鼠出生后P450aroma表达和合成下降，推测可能是导致PCOS的早期原因之一，进一步提示胎儿宫内暴露于高雄激素环境可能是PCOS病因中的重要因素之一。