四省一个直辖市精液分析外部质量控制网络建立的初步研究

周芳，王晓尉，傅龙龙，2，谷翊群,2，梁小薇，许蓬，张爱萍，温子娜，王瑞雪，卢文红*

(1.国家卫生健康委科学技术研究所，WHO人类生殖合作研究中心，国家卫生健康委男性生殖健康重点实验室，北京 100081；2.北京协和医学院研究生院，北京 100730；3.沈阳东方菁华医院，沈阳 110005；4.兰州大学第一医院生殖医学专科医院，兰州 730000；5. 成都西囡妇科医院，成都 610000；6.吉林大学第一医院，长春 130021)

精液分析是评价男性生育力和检测男性不育症的重要手段。目前，各实验室精液分析检测方法标准化的程度不尽相同，内部质量控制和外部质量控制制度尚不完善，使得各个实验室之间检测结果的可比性较差[1]。精液分析在实验室内部应遵循标准化程序进行，同时必须进行外部质控，保证精液分析实验室质控制度的充分建立，确保男科诊断技术的可持续发展。虽然精液分析标准化实施起来非常困难，但精液分析质量控制是保证分析结果准确的必要条件[2]。精液分析的质量控制越来越受到行业专家和学者的重视，部分地区的实验室也在开展精液分析质量控制，但取得的效果并不明显，精液分析的质量控制需要进一步加强[3-6]。在鼓励和帮助各单位进行内部质控的同时，逐步开展和完善精液分析的外部质控。

自2011年起，国家卫生健康委科学技术研究所组织《WHO人类精液检查和处理实验室手册(第5版)》(以下简称WHO-5)精液分析标准化培训[7]，2017年我们在北京、四川、辽宁、甘肃和吉林共五个省市开展了精液分析标准化培训，共200多名男科、生殖中心和精子库实验室技术人员接受了理论与手把手教授实验操作相结合的培训。因此，本研究在WHO-5标准化培训和内部质量控制的基础上，在全国四省一市的精液分析实验室，采取集中发放标准品和集中分析的方式，根据WHO-5精液分析标准化方法，建立精子浓度、精子存活率、精子活动力和精子浓度分析的外部质量控制网络，更好地在各个精液分析实验室中每年进行常规的外部质量控制监测，实现各实验室之间的可比性，完善男科诊断技术室的规范化和标准化分析与建立。

资料与方法

一、研究对象

2017年在辽宁省沈阳市沈阳菁华医院、甘肃省兰州市兰州大学第一医院、四川省成都市西囡妇科医院、吉林省长春市吉林大学第一医院和北京市国家卫生健康委科研所精子库，开展精液分析的实验室，包括各省市三甲医院的男科实验室、生殖中心实验室、精子库实验室和临床检验实验室，共106家单位。采用集中发放质控品和现场评估的形式。根据WHO-5推荐的标准化方法，对参加外部质控的所有实验室技术人员进行培训。这些技术人员均为长期从事精液分析的熟练操作人员。外部质控的内容包括精子浓度、活动力、存活率和精子形态学分析，其中精子浓度、活动力和存活率的精液质控品分为样本A和样本B，样本A为高浓度、高活动力和高存活率的样本；样本B为低浓度、低活动力和低活动率的样本。

二、精液分析所用的仪器和试剂

伊红-苯胺黑试剂(深圳华康生物)，巴氏染色主要染液(深圳华康生物)，稀释固定液按照WHO-5手册配制，多人共揽显微镜(Nikon，日本)，普通相差显微镜(Nikon，日本)，改良Neubauer血细胞计数板(普兰德，上海)。

三、外部质量控制实验方法

1. 精子浓度的质控和分析：制备精子浓度分析质控品。在国家卫生健康委科研所北京人类精子库的实验室中，将至少两个志愿者的新鲜精液(粘稠度正常、充分液化、无精子凝集)混合。500 μl精液分装至1.5 ml Ep管中，每管加入10%甲醛溶液(10 μl/100 μl)混匀，于4℃保存。使用之前平衡至室温，再次使用前充分混匀。

采用WHO-5手册推荐的改良Neubauer计数板的方法对预先制备好的质控品抽样进行精子浓度的评估，每个实验人员，同一样本取样两次，每次至少评估200个精子。

2. 精子活动力的质控和分析：根据WHO-5推荐的方法制备活动力湿片，用精子全自动分析仪录制标本视频录像，分别录制相当于若干个显微镜下视野的图像。每次至少评估200个精子，保证录像的放大倍数与实际标本分析时显微镜下一致。

3.精子存活率的质控和分析：根据WHO-5手册推荐的方法，制备精子存活率的质控品。分别取充分液化并混匀的高低存活率的两份精液各50 μl，与等体积的伊红苯胺黑溶液充分混匀后，制备精液涂片，封片备用。计数活精子的百分率。用100倍油镜观察，每个存活率分析精液质控品取样两次，每次至少评估200个精子。

4.正常形态精子百分率的质控和分析：根据WHO-5手册推荐的方法，取充分液化的精液并混匀，用拉片制备精液涂片，待其完全干燥后，进行巴氏染色，封片备用。每张涂片计数2次，每次至少评估200个精子。用多人共揽显微镜(Bridge Microscope)100倍油镜观察，分别计数出正常形态精子百分率。

5. 质控项目：每个单位参加质控的项目分别为：精子浓度、精子活动力、精子存活率和精子形态学评估。n代表每个地区参加外部质控的单位数量，有些项目有单位尚未开展，故n在每个项目中不完全相同。

四、统计学分析

采用SPSS 22.0 进行数据统计。n代表单位数量。分别用均数和变异系数(CV)(%)值表示各实验室之间结果的变异。采用Youden图评估各实验室的外部质控结果[7]。

结 果

一、精子浓度外部质量控制结果

1.精子浓度评估结果：仅有吉林省的各实验室之间样本A和B的CV值在15%以下；北京市样本B精子的CV值最高，为54.26%；而四川省样本A和B的CV值均大于30%(表1)。

2.Youden图评估各实验室结果：分别计算样本A和B的95%可信区间(95%CI)，并将每个地区的质控结果制作Youden图(图1)。在四省一市中分别有23.53%(8/34)、25.00%(2/8)、36.84%(7/19)、10.00%(1/10)和18.18%(2/11)实验室的两个质控品均在中间的靶窗口中，即均在95%CI内；而10.00%(1/10)、50.00%(4/8)、57.89%(11/19)、40.00%(4/10)和54.54%(6/11)实验室的其中一个质控品结果在95%CI内，另一个结果不在；其余的两次结果均不在95%CI内。

二、精子活动力外部质量控制结果

1.精子活动力评估结果：四省一个直辖市的精子活动力评估结果显示，辽宁省的样本A和B的CV值均在10%以下；四川省样本A的CV最大，为21.78%(表2)。

表1 精子浓度评估[(-±s)，%]

A：北京市；B：四川省；C辽宁省；D甘肃省；E：吉林省图1 四省一市精子浓度外部质量控制Youden图

参 数北京市(n=32)四川省(n=8)辽宁省(n=18)甘肃省(n=8)吉林省(n=10)样本A样本B样本A样本B样本A样本B样本A样本B样本A样本B均值(×106/ml)30±668±650±1138±668±670±754±639±651±643±9CV(%)19.698.7321.7814.638.369.9610.8816.3911.4620.26

2.Youden图评估各实验室精子活动力结果：分别计算样本A和B的95%CI，并将每个地区的质控结果制作Youden图(图2)。五家单位分别有9.38%(3/32)、25.00%(2/8)、44.44%(8/18)、12.50%(1/8)和30.00%(3/10)的两个质控品均在中间的靶窗口中，即均在95%CI内；而50.00%(16/32)、62.50%(5/8)、38.89%(7/18)、25.00%(4/8)和40.00%(4/10)其中一个样本结果在95%CI内，另一个样本结果不在；其余的两次结果均不在95%CI内。

三、精子存活率外部质量评估

1.精子存活率评估结果：四省一市的精子存活率的CV均在15%以下。其中辽宁省、甘肃省和吉林省的存活率均在10%以下；四川省样本B的CV最大，为13.89%(表3)。

A：北京市；B：四川省；C辽宁省；D甘肃省；E：吉林省图2 四省一市精子活动力外部质量控制Youden图

参 数北京市(n=48)四川省(n=8)辽宁省(n=19)甘肃省(n=10)吉林省(n=10)样本A样本B样本A样本B样本A样本B样本A样本B样本A样本B均值(×106/ml)68±565±767±266±964±668±685±470±465±268±6CV(%)7.9610.762.5813.899.189.134.496.503.199.89

2.Youden图评估各实验室精子存活率结果：分别计算样本A和B的95%CI，并将每个地区的质控结果制作Youden图(图3)。五家单位分别有8.33%(4/48)、37.50%(3/8)、47.37%(9/19)、10.00%(1/10)和20.00%(2/10)的两个质控品均在中间的靶窗口中，即均在95%CI内；而45.83%(22/48)、50.00%(4/8)、36.84%(7/19)、70.00%(7/10)和60.00%(6/10)其中一个质控品的结果在95%CI内，另一个结果不在；其余两次结果均不在95%CI内。

四、正常形态精子百分率的评估结果

四省一市精子正常形态百分率的CV均在20%以上；其中吉林省的CV最高，为63.06%(表4)，提示精子形态较难质控。

A：北京市；B：四川省；C辽宁省；D甘肃省；E：吉林省图3 四省一市精子活动力外部质量控制Youden图

参 数北京市(n=48)四川省(n=10)辽宁省(n=18)甘肃省(n=10)吉林省(n=9)均值(×106/ml)33±1115±913±316±614±9CV(%)34.7159.7721.5839.4563.06

讨 论

本研究采用WHO-5手册标准化方法，首次在全国四省一市进行精液分析，包括精子浓度、活动力、存活率及正常形态百分率评估的外部质控。首次尝试在精子形态学评估时尝试多人共揽显微镜的方式进行外部质控，结果显示了该方式的优越性。

Gandini等[8]在对7个样品进行的精子浓度外部质控中，CV介于29.67%和52.08%之间。Filimberti等[9]报告了15年的精子浓度分析的外部质控中，有46.65%的受试者的CV占59.03%，最高达75.14%。而本研究中精子浓度评估的结果，只有吉林省两个质控样本的CV在10%以下，其他的CV介于13.94%和54.26%之间。本研究中精子浓度评估的CV值优于上述两个实验室。而其中一个样本的CV高可能与参加外部质控的实验室数量多有关。精子浓度的CV比精子活动力和存活率的高，原因在于计数精子浓度的同时，精子在快速运动，因此精子的浓度越高，活动力越好，计数的准确度越低。而且，本研究所用的精子浓度质控标本由新鲜精液样本混合制备而成，充分混匀，并检查排除有精子聚集者。

有研究表明，精子前向运动(PR)的百分率与妊娠率呈正相关[10-11]。PR精子评估的准确性直接影响受精能力的预测。本研究中，PR精子的CV在8.36%和21.78%之间，其中有六个样本的CV小于15%。Filimberti等[9]的研究发现，三次实验中均观察到PR精子的CV高达60%，而我们的结果最高CV达到21.78%，明显优于Filimberti等[9]的研究结果。我们在进行PR精子的评估时，采用WHO-5推荐的制作视频的方式。如果有条件的话，也可以采用多人共揽显微镜，在同一视野下同时评估同一个样本的活动力，效果会更好。计算机辅助活动力分析，虽然WHO-5手册中介绍的内容不多，但其在评估精子活动力中有优势，可以获得多种参数，如平均路径速度(vap)、直线速度(vsl)、曲线速度(vcl)和头部横向位移振幅(alh)。这些参数的平均值或中间值，可以监测某些治疗或遗传干扰所导致的精子活动力变化，甚至可分辨出超活化的精子[12]。但是也有研究表明，在进行人工与计算机辅助精子分析(CASA)的精液分析质控时，除了非前向运动精子活动力之外的其他参数与人工分析的质量控制还是有显著差异的[13]。

2003年Björndahl等[14]对1 235份精液样本进行伊红苯胺黑染色法首次评估了精子活动力，得到了与在相差显微镜下评估的同等效果。而WHO-5手册中使用伊红苯胺黑评估精子的存活率。伊红苯胺黑法可以增加精子与背景的对比度，而且被染的精子不随时间延长变化而加深，封片之后可以长期保存。本研究中精子存活率外部质控结果的CV均在15%以下，在精液分析的几个项目中是最优的，提示其是最容易质控的项目之一。

正常形态精子百分率与精子功能异常、体外受精率及宫腔内人工授精(IUI)和常规IVF的成功率相关[15]。对男性生育潜力具有很高的预测价值，对于选择辅助生殖技术治疗方法至关重要[16-17]。精子形态学评估主观性强，是最难分析的指标之一[18]，与实验人员的理论标准掌握情况及评估的熟练程度密切相关。Filimberti等[9]的研究中正常形态率结果的CV在15%～90%之间，而且高CV值与染色方法和染色程序无关，他采用的三种染色方法的CV都非常高，在88.6%～105.6%之间。Punjabi等[18]的研究中，巴氏染色后的CV在44%～65%之间。他们的研究表明，这种高的CV系数可以通过不断的培训、教学和训练而逐渐改善。

本研究中，精子形态学分析的CV介于21.58%～63.06%之间，优于之前的研究结果。WHO-5手册培训之后，使用多人共揽显微镜的方式，得到了比用形态照片和单个显微镜评估更好的结果。精子形态学评估的主观性较强，评估标准的难掌握，不易稳定。再加上WHO-5手册的正常参考值下限为4%，使得临床上对精子形态学评估报告的可信度降低[15]。而且根据本研究小组在之前的调查中显示，目前精子形态学评估的染色方法超过5种，在临床中最常用的方法是Diff-Quik方法，这种方法可以快速染色和出报告，但缺点是对精子缺陷的细节染色较差；如果形态学评估的技术人员不固定，对于一些已经掌握了某种染色和评估方法的技术人员培训的效果不佳；实施形态学评估内部质量控制的实验室很少，这与法国一实验室进行的调查结果一致[19]。

Youden图显示两个样本的结果均在中间的靶窗口中，说明两个样本均在95%CI内；而如果其中一个样本结果在95%CI内，另一个样本结果不在95%CI内，提示可能由于实验过程中的随机误差而造成结果差异；两个样本的结果均高出或均低于95%CI，提示可能由于系统误差造成的结果差异。Youden图显示，辽宁省的精子浓度、活动力和存活率的结果中，两个结果均在95%CI的概率高于其他地区。精子浓度中五个省市的大部分实验室中一个样本在控。采用进口牛鲍式计数板的精子浓度质控方法优于其他方法。

本研究在全国四省一直辖市，进行了精液分析外部质量控制方法，是可行的，其结果是可靠的。本研究依赖于WHO-5手册精液分析标准化操作培训班，初步在全国范围内建立精液分析外部质量控制网络的方法，但精液分析外部质量控制网络的建立尚处于起步和探索阶段，急需进一步提高。精液分析外部质量控制需要长期坚持，任重而道远。我们期望，在WHO-5手册的标准化操作方法基础上；在本研究团队长期以来的精液分析标准化理论与操作培训的基础上；也需要从事精液分析的技术人员的共同努力，必然将在全国范围内建立精液分析外部质量控制网络。本研究团队会在实践中不断探索适合当前实际情况的外部质量控制的方法。以期逐步推动和实现全国精液分析外部质控网络的建立。