shRNA 干扰TTF- 1 基因对肺腺癌细胞EGFR- TKI 敏感性及细胞上皮间质化的影响

吕昕 周林水 陈瑞琳 杨珺超 王真

肺腺癌是肺癌中最常见的组织亚型，靶向治疗是治疗肺腺癌的重要手段，其中表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor -tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）治疗非小细胞肺癌效果肯定[1]。研究发现EGFR-TKI 治疗肺腺癌的疗效不仅与EGFR 基因突变相关，也与肿瘤细胞上皮间质转化相关（上皮间质化在EGFR-TKI 产生耐药过程中发挥了重要作用）[2]。甲状腺转录因子（thyroid transcription factor-1，TTF-1），又称甲状腺特异增强子结合蛋白（Nkx2-1），是Nkx2 基因家族中的一个包含同源结构域的转录因子，高表达于肺腺癌组织，多项研究表明TTF-1 表达与EGFR 突变存在相关性，可部分预测EGFR-TKI 的治疗效果[3]，但两者具有相关性的分子机制及两者与肺癌细胞上皮间质化的相关性尚不明确。吉非替尼为EGFR-TKI代表性药物之一，在临床广泛应用，因此本研究以吉非替尼敏感、TTF-1 高表达的肺腺癌细胞株HCC827 为细胞模型，探讨TTF-1 是否能通过干预肺癌细胞EMT 进而参与调节吉非替尼药物敏感性及其可能的分子机制，为临床EGFR-TKI 耐药的防治提供新的治疗策略。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器 HCC827（美国American Type Culture Collection 公司）、FBS（美国GIBCO 公司）、RPMI 1640 培养基（美国GIBCO 公司）、DEME 培养基（美国GIBCO 公司）、CCK-8 试剂盒（日本同仁公司）、E-钙黏蛋白C（E-cadherin，批号：YT1415，美国ImmunoWay 公司）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）（批号：GTX10095，美国Gene Tex 公司）、TTF-1（批号：SC13040，美国Santa cruzbio technlology 公司）、羊抗兔辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗（批号：A0208，中国碧云天公司）、吉非替尼（批号：YY14627-1g，纯度≥99%，上海源叶生物科技有限公司）、转化生长因子-β1（TGF-β1）（批号：1012209-1，美国Peprotech 公司）、CO2恒温培养箱（美国Thermo公司）、生物安全柜（苏州金净净化设备公司）、电泳仪mini protean 3 cell（美国BIO-RAD 公司）、电转仪PS-9（大连竞迈科技有限公司）、酶标仪MK3（芬兰雷勃酶标仪）、移液器（德国吉尔森P 型移液器公司）、基因转染6孔板（美国Costa 公司）、pRNAi-U6.2/lenti 载体、限制性内切酶XhoI 和HpaI（上海NEB 公司）、LipofectAMINE 2000 转染试剂盒（批号:11668-019，美国Invitrogen 公司）。

1.2 shRNA 表达载体的构建 靶向TTF-1 的特异性干扰序列为5′-GACGCUUCAAGCAACAGAA- 3′，阴性对照序列为5′-CGUUCUCAGUGUCUGACAU- 3′。将目的片段插入pRNAi-U6.2/lenti 载体的XhoI 和HpaI 位点，分别构建 pRNAi-U6.2/lenti-TTF-1-GEP-shRNA 和pRNAi-U6.2/lenti-NC-GEP-shRNA，作为阳性干扰质粒和阴性对照质粒，进行阳性克隆筛选并鉴定（图1）。

图1 pRNAi-U6.2/lenti 载体图谱

1.3 细胞培养 将对数生长HCC827 细胞用胰蛋白酶进行消化后加入含10%FBS 的37℃的RPMI 1640 培养基中，以9×105个/ml 细胞种于75T 培养瓶中，置于培养箱。当细胞生长融合至70%～80%，用无血清培养基饥饿24h，使细胞静止于同步期。

1.4 细胞分组 将HCC827 细胞分成空载体组、阴性质粒转染（NC-shRNA）组和阳性质粒转染（TTF-1-shRNA）组。基因转染6 孔板内每孔种植2.0×10s HCC827细胞（1～8ml 含血清培养基），培养24h。按照LipofectAMINE2000 转染试剂盒说明书进行转染：取3 组不同表达质粒10μg，按照1∶2 的比例加入转染试剂，将DNA和转染试剂混合液温育10min 后，再补充转染试剂至总体积达100μl，将其加至各组的HCC827 细胞中。37℃孵育48h 后，荧光显微镜下观察细胞的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表达情况，计算转染效率，转染效率=绿色荧光细胞数/视野内细胞数×100%。分选细胞，验证转染效果。空载体组不做处理。

1.5 细胞凋亡率和细胞周期各时相所占百分比检测 将培养好的不同组别细胞经胰酶消化后计数，充分吹打，1 000r/min 离心5min，弃上清液，细胞沉淀用100μl浓度为1mg/ml 的RNase A 溶液悬浮，在37℃培养箱内消化细胞内的RNA，加入将400μl 浓度为50μg/ml 的碘化丙啶（PI）溶液，避光染核10min。随即使用流式细胞仪检测，Annexin V-FITC 为绿色荧光，PI 为红色荧光，对细胞DNA 含量进行测定，进行细胞凋亡分析：四象限中P2-UL 代表坏死细胞，P2-UR 代表晚期凋亡细胞，P2-LR 代表早期凋亡，P2-LL 代表未发生凋亡的细胞，细胞凋亡率为P2-UR 与P2-LR 百分率之和。计算各细胞周期G0/G1 相、S 相、G2/M 相所占百分比，确定细胞在各个时相的分布状态，进行细胞周期分析。

1.6 细胞生长抑制率检测 采用CCK-8 法。将转染24h 的各组细胞经胰酶消化后计数，以1×105/ml 细胞密度，接种于96 孔板，每孔100μl。待细胞长至80%～90%时加入不同浓度的吉非替尼（10、20、40、60μmol/ml），每孔设6 复孔，外周孔空置设仅含培养基的空白对照。药物作用72h 后每孔加入10μlCCK-8，孵育2h，酶标仪测450nm 吸光度A 值。空白对照细胞活力设为1。按公式计算细胞生长抑制率（%）=1-细胞活力%=1-[（A 加药）-（A 空白）]/[（A0 加药）-（A 空白）]×100%。其中A 加药指具有细胞、CCK-8 溶液和药物溶液的孔的吸光度；A空白指具有培养基和CCK-8 溶液而没有细胞的孔的吸光度；A0 加药指具有细胞、CCK-8 溶液而没有药物溶液的孔的吸光度。

1.7 TGF-β1诱导细胞上皮间质化 予高浓度5ng/ml TGF-β1作用于各组细胞，连续48h 在倒置显微镜下观察细胞形态的动态变化至发现细胞由原有上皮细胞的鹅卵石状变为梭形并继续变细长，部分细胞可见轴突样结构，完全演变为间质细胞形态，提示细胞发生了上皮间质化。

1.8 TTF-1、E-cadherin 和α-SMA 蛋白表达水平检测 采用Western blot 法。取培养细胞，PBS 洗涤，吸去培液，适量预冷的1×PBS 洗涤2 次，吸去PBS，采用蛋白裂解液提取细胞总蛋白，用BCA 法测定总蛋白含量，定量后贮存于-80℃冰箱，将蛋白裂解液溶解在等量的2×样品缓冲液中100℃加热5min，蛋白上样进行SDS-PAGE电泳，聚偏氟乙烯膜（PVDF）进行转膜，将膜放入封闭液（5%脱脂奶粉）中室温封闭1h，加入一抗4℃孵育过夜，TBST 漂洗5min×3，转膜后采用5%脱脂奶粉封闭1h，将膜放入封闭液（5%脱脂奶粉）中室温封闭1h，加入一抗4℃孵育过夜，稀释HRP 标记的二抗，与膜37℃孵育1h，TBST 漂洗5min×3，采用增强化学发光法（ECL）进行显色反应，用光密度扫描仪记录，图像分析软件进行分析，以GAPDH 为内参，进行统计分析。

1.9 统计学处理 采用SPSS 17.0 统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；组内不同浓度吉非替尼作用后细胞生长抑制率的比较采用重复测量的方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组细胞凋亡率和细胞周期各时相所占百分比的比较 3 组细胞凋亡率之间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。其中，与NC-shRNA 组、空载体组比较，TTF-1-shRNA 组细胞凋亡率均明显增加，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而空载体组与NC-shRNA 组比较，细胞凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05），见图2（插页）、表1。3 组细胞周期G0/G1 相、S 相和G2/M 相所占百分比之间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。其中，与NCshRNA 组、空载体组比较，TTF-1-shRNA 组细胞周期中G0/G1 相所占百分比均升高，S 相和G2/M 相所占百分比均降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而空载体组与NC-shRNA 组比较，细胞周期各时相所占百分比比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见图3（插页）、表1。

图2 Annexin V/PI 双染法分析细胞凋亡

图3 流式细胞术分析细胞周期变化

2.2 不同浓度吉非替尼作用后3 组细胞生长抑制率的比较 不同浓度吉非替尼作用后，每组细胞的生长抑制率均随药物浓度的增加而升高，不同浓度间的差异有统计学意义（P＜0.05）。同一浓度时，3 组细胞生长抑制率之间比较差异有统计学意义（P＜0.05）；TTF-1-shRNA组较NC-shRNA 组、空载体组均明显为高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而空载体组与NC-shRNA 组比较，仅在吉非替尼20μmol/ml差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表1 3 组细胞凋亡率和细胞周期各时相所占百分比的比较（%）

2.3 TGF-β1诱导HCC827 细胞上皮间质化后细胞形态变化 观察细胞形态的动态变化发现细胞由原有上皮细胞的鹅卵石状变为梭形并继续变细长，部分细胞可见轴突样结构，完全演变为间质细胞形态，提示细胞发生了上皮间质化，见图4（插页）。

图4 TGF-β1 诱导HCC827 细胞上皮间质化后细胞形态变化（×150）

2.4 3 组细胞TGF-β1作用前后TTF-1、α-SMA、Ecadherin 蛋白表达水平比较 TGF-β1作用前后，3 组细胞TTF-1、α-SMA、E-cadherin 蛋白表达水平之间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。其中，与空载体组和NCshRNA 组比较，TGF-β1作用前后，TTF-1-shRNA 组细胞TTF-1、α-SMA 蛋白表达水平均为降低，E-cadherin蛋白表达水平均为增高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与TGF-β1作用前比较，TGF-β1作用后NCshRNA 组和空载体组TTF-1、E-cadherin 蛋白表达水平均下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与NC-shRNA组、空载体组比较，TTF-1-shRNA 组TGF-β1作用前后细胞E-cadherin、α-SMA 蛋白变化不明显，差异无统计学意义（P＞0.05），见图5、表3。

图5 TGF-β1 作用前后3 组TTF-1、α-SMA、E-cadherin 蛋白表达的电泳图

3 讨论

TTF-1 是NKX2-1 家族的成员，最早发现与甲状腺的功能及相关疾病有关，在肺组织中主要在Ⅱ型肺泡上皮和无纤毛的支气管上皮细胞表达，TTF-1作为肺腺癌的重要免疫标记已在临床病理诊断中广泛应用[4]。多项研究表明TTF-1 与EGFR 突变存在相关性[5-7]。2011 年ASCO 会议报道：TTF-1 阴性表达的肺腺癌，EGFR 突变率非常低，提示TTF-1 可以预测EGFR 突变，TTF-1 的表达情况不仅与肺腺癌细胞对EGFR-TKI的敏感性存在联系[8]，也与肺癌细胞上皮间质化存在相关性[9]。上皮细胞间质化（EMT）与肿瘤细胞的侵袭、转移密切相关，在肿瘤药物的原发耐药与获得性耐药过程中也发挥了重要作用，有研究表明E-cadherin 表达的上皮表型肺癌细胞对EGFR-TKI 敏感性高[10]。TGF-β1是调控EMT 的“主开关”并已被证明主要通过2/3 SMAD 信号通路完成，且不受其他通路影响[11]。

表2 不同浓度吉非替尼作用后3 组细胞生长抑制率的比较（%）

表3 TGF-β1 作用前后TTF-1、α-SMA、Eca 蛋白的表达

本研究以吉非替尼敏感、TTF-1 高表达、E-cadherin表达的上皮表型肺腺癌HCC827 细胞为研究对象，结果显示干扰沉默TTF-1 基因后，肺癌细胞周期阻滞在G0/G1 期，肿瘤细胞生长抑制率显著高于对照组，肿瘤细胞对吉非替尼敏感性较对照组显著增加，肿瘤细胞上皮表型E-cadherin 蛋白表达增高，间质表型α-SMA 蛋白表达下降。与对照组比较，TGF-β1作用后，干扰沉默TTF-1基因的细胞E-cadherin、α-SMA 蛋白变化不明显，提示细胞上皮间质化部分被抑制。本研究证实了肿瘤细胞内源性TTF-1 表达、上皮间质转化（EMT）与EGFR-TKI 敏感性有着密切关系，TTF-1 表达率高、上皮表型蛋白表达率高均提示对EGFR-TKI 敏感性高。

TTF-1 基因在本研究中呈双作用，有学者用Fisher精确检验分析显示TTF-1 阳性表达与EGFR 外显子21突变存在强相关性[12]，而笔者所用实验细胞株HCC827，前期经NGS 法检测显示其存在EGFR 外显子19 突变。因此，我们推测EGFR 不同突变与TTF-1、EMT 相关性在机制上存在差异：沉默EGFR 外显子19 突变表达肺癌细胞HCC827 的TTF-1 基因后，间质标志蛋白α-SMA 表达下降，上皮标志蛋白E-cadherin 表达上升，部分减轻TGF-β1诱导的HCC827 细胞上皮间质化的过程，增加了EGFR-TKI 的敏感性，具体相关机制及作用位点有待进一步研究。