伊曲康唑对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠骨髓源性抑制细胞的影响及意义

黎媛 李伟文 蓝秀 吕祝庆

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是临床上常见的不可逆性呼吸道顺应性下降的慢性肺部疾病[1]，其发病机制与持续炎症反应、氧化应激以及蛋白酶功能紊乱等有关。一些研究发现免疫功能紊乱，尤其是CD4+和CD8+T 细胞免疫功能紊乱是导致呼吸道黏膜上皮损害的重要原因[2]。近年来，有研究表明骨髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）除了参与肿瘤微环境免疫抑制外，还与COPD 等炎症性疾病密切相关。MDSC 在COPD 疾病进展中的作用仍存在较大争议[3-4]。免疫调节剂（如胸腺肽）可缓解COPD 病情，减少急性发作，其作用机制是否与MDSC 状态有关仍需进一步探讨。伊曲康唑是一种广谱抗真菌药物[5]，可明显改善COPD 合并真菌感染患者的病情[6]。由于缺乏临床用药指征，伊曲康唑仍未应用于治疗非真菌感染性COPD 患者。近年来，越来越多的学者发现伊曲康唑具有广泛的非抗真菌作用，如抗肿瘤、抗炎、抑制血管生成、调节细胞自噬、免疫调节等[7-10]，但其对无真菌感染性COPD 患者的MDSC 的影响仍未明确，因此，本研究观察伊曲康唑对COPD 模型大鼠MDSC 的影响及意义，以进一步阐明伊曲康唑治疗COPD 的内在机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 40 只6～8 周龄健康雄性SD 大鼠，许可证号：SCXK（浙）2015-009，体重约200～250g，购自温州医科大学实验动物中心。

1.2 主要材料 人淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque 购自北京普博斯生物科技有限公司；Anti-Ly6g（Gr-1）、Anti-CD11b 抗体均购自中国Abcam 公司；诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）、转化生长因子-β（TGF-β）、精氨酸酶1（ARG1）、β-肌动蛋白（β-actin）抗体均购自美国CST 公司；伊曲康唑购自上海阿拉丁试剂有限公司；增强化学发光（ECL）试剂盒购自美国Thermo 公司。

1.3 构建COPD 模型及实验分组 按随机数字表法将40 只大鼠分为对照组、模型组、低剂量组和高剂量组4组，每组10 只。对照组给予常规喂养，后3 组按被动香烟烟雾吸入法构建COPD 模型[11]，低剂量组和高剂量组大鼠于被动吸烟12 周后，分别口服10mg/kg 和50mg/kg伊曲康唑，1 次/d，共4 周。

1.4 大鼠气道阻力和顺应性检查 建立模型16 周后，采用腹腔注射10%水合氯醛溶液（3.8ml/kg）将大鼠麻醉，进行气管插管并连接到流速传感器，采用小动物肺功能监测系统观察大鼠呼吸的流量和压力曲线，测量并计算第0.3s 用力呼气量与用力肺活量的比值（FEV0.3/FVC）、肺顺应性和气道阻力，测量完成后采用空气注射法处死大鼠，为后续试验准备。

1.5 小气道病理学评分 按照文献[12]中的方法，取左肺组织，以4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片，HE染色后，由经验丰富的工作人员阅片，观察以下指标：（1）小气道腔内黏液和细胞阻塞情况，取阻塞小气道的百分比；（2）小气道上皮坏死糜烂的百分值；（3）上皮细胞杯状化生程度；（4）上皮细胞鳞状化生程度；（5）炎症细胞浸润程度；（6）组织增生程度；（7）平滑肌增生程度；（8）色素沉着程度。3～8 项按正常为0 分、轻度为1 分、中度为2 分、重度为3 分进行评分，将所观察的小气道评分值相加后，与最大总分数（即3×小气道数）的比值即为小气道病理学评分值。

1.6 外周血中MDSC 比例检测 采用流式细胞仪技术。按照实验分组构建模型，并给予伊曲康唑治疗16周。收集各组大鼠的外周血液，按照密度-梯度离心法分离各组大鼠的单个核细胞，加入抗体CD11b 和Gr-1，冰上避光孵育20min，采用流式细胞技术分析Gr-1+CD11b+MDSC 比例。

1.7 肺组织中MDSC 计数检测 采用细胞免疫荧光技术。提取肺组织细胞后，以4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片、脱蜡，用0.3%甲醇-过氧化氢溶液灭活内源性过氧化酶，并用0.1mol/L 柠檬酸盐缓冲液抗原修复。10%山羊血清在37℃湿盒内处理30min。加一抗抗体，湿盒中，37℃孵育1h，4℃过夜；漂洗2 次后，加入二抗抗体，湿盒中，37℃孵育1h，漂洗2 次，加入显示液避光显色15min，终止反应；苏木精对比染色、脱水、透明、封固、光镜观察3 个视野，统计细胞数，并计算平均值。

1.8 iNOS、TGF-β、ARG1 蛋白表达水平检测 采用Western blot 法。收集适量的右肺组织，并制成匀浆后，加入适量的组织裂解液，冰上裂解10～15min，4℃离心机中，以12 000r/min 离心15min，取上清液。经蛋白定量后，取20μg 总蛋白4%～12%聚丙烯酰胺凝胶中，电泳分离；经电转膜后，用3%脱脂牛奶室温封闭30～60min。加入一抗（iNOS、TGF-β、ARG1），4℃孵育过夜；TBST 缓冲液洗涤，每次8～10min，共3 次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1～2h，TBST 缓冲液洗膜，每次8～10min，共3 次，用增强化学发光试剂发光、显影和定影，Image J 软件计算条带的灰度值，以β-Actin 为内参。上述实验重复3 次。

1.9 iNOS、TGF-β、ARG1 mRNA 表达水平检测 采用RT-PCR 法。收集新鲜的病变肺组织，加入适量的Trizol液，提取总RNA，并合成cDNA。用AccuPowerRGreenstarTMqPCR PreMix 试剂盒配置20μl 的总反应体系，包括：cDNA 1μl、上下游引物各0.8μl，qPCR PreMix 10μl，0.9%氯化钠溶液7.4μl，进行PCR 扩增。扩增条件：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火延伸34s，溶解65～95℃，每5s 上升0.5℃；使用2-△△Ct表示基因表达情况。引物系列见表1。

1.10 统计学处理 采用SPSS 22.0 统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

表1 引物序列

2 结果

2.1 4 组大鼠FEV0.3/FVC、肺顺应性、气道阻力及小气道病理学评分比较 与对照组相比，模型组FEV0.3/FVC和肺顺应性明显降低，气道阻力和病理评分明显增高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与模型组相比，低剂量组和高剂量组FEV0.3/FVC 和顺应性明显增高、气道阻力和病理评分明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表2。

表2 4 组大鼠FEV0.3/FVC、肺顺应性和小气道阻力及气道病理学评分比较

2.2 4 组大鼠MDSC 在外周血的比例和肺组织中计数比较 与对照组相比，模型组外周血MDSC 比例和肺组织中计数均明显增高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与模型组相比，低剂量组和高剂量组外周血MDSC 比例和肺组织中计数均明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表3。

表3 4 组大鼠MDSC 在外周血的比例和肺组织中计数比较

2.3 4 组大鼠肺组织中iNOS、TGF-β、ARG1 表达水平比较 与对照组相比，模型组iNOS、TGF-β、ARG1 蛋白和mRNA 表达上调，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与模型组相比，低剂量组和高剂量组iNOS、TGF-β、ARG1 蛋白和mRNA 表达上调明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表4、图1。

3 讨论

自1980 年首次成功合成后，伊曲康唑通过其三唑环结构阻断真菌细胞膜麦角固醇的合成来抑制真菌生长，从而发挥其抗真菌药物的作用，临床上常用于治疗浅表真菌感染及深部真菌引起的系统感染，具有良好的疗效和较低的毒性。在COPD 合并真菌感染治疗中，伊曲康唑亦可使患者获得较好的临床疗效[6]。本研究结果提示，单一的伊曲康唑可改善COPD 大鼠的肺功能，减轻大鼠气道炎症反应，具有抑制肺部炎性损伤作用，提示伊曲康唑具有潜在的治疗COPD 的作用。

表4 4 组大鼠肺组织中iNOS、TGF-β、ARG1 表达水平比较

图1 4 组大鼠肺组织中iNOS、TGF-β、ARG1 表达的电泳图

MDSC 是一群由髓源性祖细胞在不同阶段分化的未成熟异质性细胞群，缺乏成熟性中性粒细胞、巨噬细胞或树突细胞的细胞表型，其鼠源性MDSC 表型以Ly6g（Gr-1）和CD11b 为标志，人源性MDSC 表型则为LIN-HLA-DR-CD33+或CD11b+CD14-CD33+[13]。在炎症性疾病、创伤应激、自身免疫疾病、脓毒症，尤其是肿瘤微环境中，MDSC 可通过分泌ARG1 和iNOS，增加局部氧自由基含量和炎性细胞因子（如TGF-β），降低L-精氨酸的含量，抑制T 细胞增殖和免疫功能。此外，MDSC还可以直接与调节性T 细胞、Th1 细胞相互作用，起到间接免疫抑制作用[13-15]。近年来，越来越多的研究发现非肿瘤性肺部疾病中，如肺纤维化、肺动脉高压、急慢性肺炎均具有不同程度的免疫功能紊乱的现象，且其机制可能与MDSC 的免疫抑制作用有关[16-17]。有学者发现COPD 患者的外周血中MDSC 比例明显增加，且伴随有调节性T（Treg）细胞比例增加和T 细胞功能紊乱，这提示MDSC 参与COPD 患者免疫调节的过程[13]。本研究在构建的COPD 大鼠模型中也发现外周血MDSC 比例及肺组织中MDSC 计数均较对照组明显增高，肺组织中iNOS、TGF-β、ARG1 表达也明显增高，提示MDSC 可能与COPD 疾病发生、发展有关。在经过低剂量和高剂量的伊曲康唑治疗后，外周血MDSC 比例、肺组织中MDSC 计数和iNOS、TGF-β、ARG1 均明显下降，提示伊曲康唑对MDSC 具有调节作用。

通过本研究，笔者初步证实了在COPD 大鼠模型中，外周血MDSC 比例、肺组织中MDSC 计数以及其分泌的细胞因子（包括iNOS、TGF-β、ARG1）明显增加。而伊曲康唑可改善COPD 大鼠的肺功能，减轻肺部炎症性反应，具有抑制肺部损伤作用，但由于实验过程中未涉及到伊曲康唑是否参与MDSC 抑制T 细胞功能的研究，因此仍未明确伊曲康唑对COPD 免疫抑制状态是否有影响，需进一步研究证实。

综上所述，伊曲康唑降低COPD 大鼠的MDSC 比例以及细胞因子，有助于改善COPD 大鼠的肺功能、减轻气道炎症反应关。