鹿瓜多肽及骨髓基质干细胞经股动脉注入治疗骨折不愈合的实验研究

蔡俊 郑光磊 沈晓强 顾晓民

高能量损伤患者骨折程度常较严重，且多伴有骨质缺损，容易发生骨折不愈合（约占长骨骨折的5%～10%[1-2]）。骨折不愈合具有病程长、需多次手术和常发生骨畸形等特点，临床治疗有一定难度，治疗方法也多种多样，但疗效和安全性褒贬不一。为此，本研究通过建立新西兰兔骨折不愈合模型，然后经股动脉注入鹿瓜多肽和转染的荧光骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cell, BMSC）混合液，观察其治疗骨折不愈合的疗效和安全性，并探讨其机制，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 普通级新西兰兔[杭州师范大学医学实验动物中心，许可证号：SYXK（浙）2016-0014]，FBS（德国PAN 公司），鹿瓜多肽（哈尔滨誉衡制药有限公司，4ml/支，批号：1602629），兔BMSC 和慢病毒（美国赛业生物公司，1×106/管，病毒颗粒≥1×108/TU，批号：VB150915-10026），碱性磷酸酶试剂盒（德国德赛公司），骨钙素试剂盒（德国Roche 公司），倒置相差显微镜（日本Nikon Ti-E 公司）,荧光显微镜（德国Leica DMi8 公司），全自动生化仪（美国Beckman-Coilter AU5800 公司）和全自动免疫分析仪（德国Roche E602 公司）。本实验严格遵守实验动物福利准则。

1.2 方法

1.2.1 造模 选取21 只健康雄性新西兰兔，体重（2.5±0.5）kg，所有实验动物均单独饲养，每只兔均选取左后肢用于实验。无菌原则下全身麻醉后，聚维酮碘消毒左后肢。暴露股骨后锯断股骨，造成横行骨折，将骨折端切除0.5cm，剥除骨折远近端约0.5cm 骨膜，然后使用直径1.5～2.0mm 克氏针固定，造成骨折不愈合模型。常规饲养，术后应用抗生素预防感染。

1.2.2 分组及用药 将21 只新西兰兔按随机数字表法分为对照组（A 组）、穿刺组（B 组）、经股动脉组（C 组）3组，每组7 只。A、C 组骨折不愈合模型建立同时于同侧股动脉插入留置针导管并引出体外。再通过留置导管注入对比剂，确认股动脉及分支通畅情况。兔BMSC 溶液经慢病毒转染制成显绿色荧光的BMSC 后，与鹿瓜多肽注射液混合应用。A 组：首次于手术结束时通过股动脉导管注入0.9%氯化钠注射液10ml，术后再每周1 次，共7 次；B 组：首次于手术结束时经皮穿刺直接在骨折端注入鹿瓜多肽注射液（0.5ml/kg）及转染的荧光BMSC（1×106个细胞，0.5ml）混合液，用0.9%氯化钠注射液稀释至10ml，术后再每周1 次，共7 次；C 组：首次于手术结束时通过股动脉导管注入同B 组的混合液，术后再每周1 次，共7 次。

1.2.3 骨痂X 线检查与Nordsletten 评分 术后第1、4、7 周摄X 线片，观察骨痂生成、骨折愈合情况，以X 线片可见骨痴通过骨折线且骨折线接近消失作为骨折愈合判定标准，由2 位有工作经验的放射学医师按照骨痂Nordsletten 评分标准[3]进行独立评价：0 级：无骨痂；1级：仅见少量骨痂；2 级：骨痂量正常；3 级：骨痂量过度。

1.2.4 碱性磷酸酶（ALP）和骨钙素（OCN）水平测定分别采用免疫发光法和电化学发光法。术后第1、4、7 周抽取耳缘静脉血5ml 离心后取上清液，分别应用全自动生化仪和全自动免疫分析仪行ALP 和OCN 水平检测。

1.2.5 荧光细胞观测和分析 第7 周给药后第2 天处死动物，截取股骨骨折远近端1.5cm 骨质，用高糖DMEM 培养基溶液反复冲洗骨质，吹洗出其中的BMSC，经离心后接种于培养皿中，在荧光显微镜200 倍条件下观察转染的荧光BMSC 的形态和聚集情况，并对同一视野用倒置相差显微镜100 倍条件下观察所有BMSC。用MATLAB 图像分析软件在200 倍条件下对A、B、C 组的荧光图像进行处理，以未转染组荧光图像的背景基础亮度为最低阈值，比较B、C 两组荧光细胞所占面积（△S），并以此面积占图像总面积（S）的百分数即△S / S 比值（%）进行统计学分析。

1.3 统计学处理 采用SPSS 18.0 统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组新西兰兔骨痂X 线检查结果和Nordsletten 评分比较 术后A 组第1 周无骨痂生成，第4 周骨折近端少量骨痂生成，骨折移位，第7 周少量骨痂反而部分吸收，骨折线清晰，骨折不愈合模型确立；B 组第1 周可见骨折端外侧少量骨痂生成，第4 周外侧可见明显骨痂生成，包裹骨折端，内侧骨痂未见生成，骨折线清晰，第7 周骨折端外侧骨痂生成明显，内侧骨痂少量生成，骨折线基本消失；C 组第1 周可见骨折端内侧少量骨痂生成，第4 周内外侧可见较多骨痂生成，包裹骨折端，尤以内侧骨痂生成明显，骨折线不清，第7 周骨折端内外侧明显骨痂生成，骨折线消失，骨折塑形良好，见图1。C组骨痂Nordsletten 评分不同时间点均高于A 组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；C 组骨痂Nordsletten 评分第1 周和B 组比较差异无统计学意义（P＞0.05），第4、7 周则均明显高于B 组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

图1 3 组新西兰兔术后骨痂X 线检查结果（a:A 组第1、4、7 周；b:B 组第1、4、7 周；c:C 组第1、4、7 周）

表1 3 组新西兰兔骨痂Nordsletten 评分比较（分）

2.2 3 组新西兰兔ALP 和OCN 水平比较 术后C 组第1、4、7 周血清ALP 水平均较A 组和B 组均有明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），各组第7 周ALP水平反而比第4 周减少；C 组术后第1、4、7 周血清OCN水平较A 组和B 组明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2、3。

表2 3 组新西兰兔ALP 水平比较（U/L）

表3 3 组新西兰兔OCN 水平比较（ng/ml）

2.3 3 组新西兰兔荧光细胞的形态、聚集情况和△S / S比值比较 B、C 组均可见明显呈活性状态显绿色荧光的BMSC，且C 组可见更多BMSC 聚集，A 组则无荧光细胞可见。同一视野下倒置相差显微镜显示B、C 两组注入经转染显绿色荧光的BMSC 和动物本身BMSC 共同生长良好，形态上无明显差别，见图2、3（插页）。C 组△S/S 比值明显高于B 组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

图2 C 组荧光细胞显微镜下所见（a-b：荧光显微镜下所见，×200；c：同一视野下倒置相差显微镜所见，×100）

图3 B 组荧光细胞显微镜下所见（a-b：荧光显微镜下所见，×200；c：同一视野下倒置相差显微镜所见，×100）

表4 两组新西兰兔△S/S 比值比较（%）

3 讨论

目前临床上治疗骨折不愈合的方法以内、外固定加植骨手术为主[4-7]，但新的方法如含促骨形成基因的腺病毒载体疗法和低强度脉冲超声技术也在不断涌现[8-9]。然而，由于自体供骨来源有限，供体部位手术创伤大，易发生感染、疼痛等并发症，极大地限制了这些技术的应用。BMSC 在体内不仅可以增殖并向成骨细胞转化，直接参与骨折的修复，而且成骨细胞分泌的一些细胞因子也为修复提供了微环境，加速骨折的修复，其应用为临床上治疗骨折不愈合提供了一种新的方法[10-11]。国外学者的研究显示在内固定同时接受BMSC 植入是一种安全有效的治疗方法，患者术后影像学检查表现出骨痂生成更快，而骨痂早期生成能极大地改善患者的运动功能[10-11]。国内童培建等[12-13]经皮注射或经旋股内外动脉注射BMSC 治疗股骨头坏死，经长期随访取得了良好的临床疗效，这一方法有利于恢复股骨头内血液供应，提高局部成骨能力，促进死骨修复。本研究C 组经股动脉注入鹿瓜多肽和BMSC 混合液后骨痂生成量、ALP 和OCN水平均较A 组、B 组明显增加，差异有统计学意义，且通过荧光示踪技术可以观察到转染的荧光BMSC 经股动脉注入后能顺利到达骨折端并发挥作用，与兔自身BMSC 共存，无一只实验兔因感染或排斥反应而死亡，该方法操作简单易行，鹿瓜多肽和BMSC 混合液经血管注入安全性较高，能明显促进骨折愈合。

目前建立动物骨折不愈合模型方法有截骨法、机械活动法和组织嵌入法等[14-15]。本研究将新西兰兔骨折端切除0.5cm，并剥除骨折远近端约0.5cm 骨膜，然后使用克氏针固定，造成骨折不愈合模型，A 组术后第7 周骨折线仍清晰，骨痂量少且出现骨痂吸收情况，达到临床骨折不愈合标准，表明该方法操作简单，造模成功。B 组和C 组随着细胞和药物干预时间延长，骨痂生成增多，至第7 周骨折线基本消失，但是C 组较B 组骨痂生成量更多，且内外骨痂生成量均明显，C 组第1、4、7 周骨痂Nordsletten 评分均比A 组、B 组高（仅第1 周与B 组相比差异无统计学意义）。笔者认为原因有：A 组因骨痂生成量少，骨折端不稳定，微动又可影响骨痂生成；B 组需每次透视下穿刺给药，且范围局限，在骨折周围重新建立新生血管需要一定时间；而C 组直接将药物及细胞注入股动脉，不但短时间内直接作用到骨折受损血管，而且能通过供血动脉和侧支循环直接作用于骨折端，促进成骨。这也与C 组在荧光显微镜下观察到更多BMSC 聚集和△S / S 比值更高相一致，表明经股动脉注入鹿瓜多肽及BMSC 更能够促进骨痂生成，更有效地治疗骨折不愈合。

现已证明ALP 是成骨细胞早期分化的特异性标志物之一，参与调节成骨细胞分化，提供骨盐，利于成骨，其活性越高，说明前成骨细胞向成熟成骨细胞分化越明显[16-18]。OCN 仅由成骨细胞合成，是成骨细胞分化成熟和骨形成的指标[17-19]。本研究各组术后第7 周ALP 水平反而比第4 周减少，这与ALP 是成骨细胞早期分化因子，而第7 周B 组和C 组已处于骨塑形阶段，A 组处于骨不愈合阶段有关。OCN 是成骨细胞在基质矿化阶段的表达产物，因而各组术后第1、4、7 周血清OCN 水平随着细胞和药物作用时间延长而逐渐升高。C 组术后第1、4、7 周ALP 和OCN 水平均较A 组、B 组明显升高，差异均有统计学意义，这表明经股动脉注入鹿瓜多肽及BMSC 能增强ALP 和OCN 的表达，从而促进成骨细胞分化，有利于骨折愈合，这也在影像学观察中得到了证明。

BMSC 只有聚集在骨折端才能更有效发挥促成骨细胞分化作用，从而为骨折愈合奠定基础。B、C 组从截取骨折段吹洗出经慢病毒转染显绿色荧光的BMSC 可以直接在荧光显微镜下观测，C 组较B 组BMSC 聚集更多，形态上无明显差别，都呈单层生长，多为长梭形或类三角形，这与BMSC 正常培养的活性状态一致。倒置相差显微镜下可见注入的荧光BMSC 与兔本身BMSC 共同生长，形态亦无差别，因而具有可比性。用MATLAB图像软件分析△S/S 比值，C 组较B 组高，差异有统计学意义。这直接说明经股动脉注入鹿瓜多肽及BMSC 治疗骨折不愈合安全有效，BMSC 能够顺利到达骨折端，并与动物本身BMSC 共生，显示出良好活性状态，无排斥反应。C 组因为注入的BMSC 聚集到骨折端周围更多，从而成骨、促进骨折愈合作用更明显，这与影像学观察和相关成骨因子指标检测结果相一致。

鹿瓜多肽注射液可经血管滴注，是骨科常用的一种较为安全的中药复方制剂，药理研究表明不仅可以促进成骨细胞分化表达，且能降低骨折局部毛细血管通透性，减少炎性渗出，减轻疼痛，同时还能降低全血黏度和红细胞聚集程度，改善骨折周围血液循环，为骨细胞提供一个良好的生长环境[20]。故本研究选用此药物，结果证明其与BMSC 制成混合液后，BMSC 能保持活性状态，而且可以协同发挥促骨形成作用。

总之，经股动脉注入鹿瓜多肽及BMSC 治疗骨折不愈合操作简单可行，安全性高，能有效促进骨折愈合，疗效确切。但本研究存在样本量偏少、缺乏硬组织切片观察等缺点，有待进一步研究验证。