雷公藤内酯醇对肺癌荷瘤小鼠髓系抑制性细胞的影响及机制研究

孙蕾 赵嘉璐 蓝秀 吕祝庆 黎媛 李伟文

研究表明雷公藤内酯醇具有显著的抗肿瘤作用，其抗肺癌作用与诱导细胞凋亡、细胞周期阻滞有关。雷公藤内酯醇可通过微小RNA-21 促进第10 号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物基因表达，诱发肺癌细胞凋亡[1]。雷公藤内酯醇及其衍生物可激活p53-沉默调节蛋白3 途径从而诱发线粒体功能损伤，抑制肺癌细胞增殖[2]。在人源肺癌异种移植模型中证实雷公藤内酯醇衍生物通过抑制无翅型乳腺癌病毒整合位点家族成员1通路来促进细胞凋亡，并降低细胞的迁移和侵袭能力，防止肺癌转移[3]。雷公藤内酯醇还能通过抑制丝裂原活化蛋白激酶和磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B 信号通路来增加耐药性肺癌A549 细胞对化疗药物的敏感性，促进细胞凋亡，诱导细胞周期阻滞[4]。然而雷公藤内酯醇对肺癌肿瘤免疫的影响及机制仍未完全明确。本研究将通过多种方法观察雷公藤内酯醇对肺癌A549 细胞荷瘤小鼠髓系抑制性细胞（MDSC）的影响，并探讨其潜在的分子机制，为雷公藤内酯醇治疗肺癌提供科学根据。

1 材料和方法

1.1 材料 主要试剂：雷公藤内酯醇（纯度≥98%，批号:38748-32-2，粉剂，50mg/支）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，4-苯基丁酸钠（4-PBA，批号：S4125，粉剂，50mg/支）购美国自赛莱克化学公司；β-肌动蛋白（β-actin）、B 淋巴细胞瘤-2 基因（Bcl-2）、B 淋巴细胞瘤-2 基因相关X（Bax）、CCAAT-增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）、内质网应激相关分子葡萄糖调节蛋白-78（GRP78）和蛋白激酶R 样内质网激酶（PERK）单克隆抗体均购自美国细胞信号技术公司；CD16/CD32（批号：16-0161-82）、PE-Cy5-Gr-1（批号：15-5931-81）、FITCCD11b（批号：11-0112-41）抗体均购自美国英杰生命技术有限公司；RT-qPCR 相关试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。细胞：肺癌A549 细胞购自上海生命科学细胞库。6～8 周龄、体重（20.1±2.3）g 的C57BL/6 小鼠购自温州医科大学实验动物中心，动物许可证号：SCXK（浙）2015-009。

1.2 细胞培养与细胞悬液配制 肺癌A549 细胞用含10FBS、100U/ml 青霉素、100μg/ml 链霉素的杜尔伯科改良伊格尔培养基培养，接种于培养皿后，置入37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养，取对数生长期细胞，在无菌条件下，用0.25%胰酶消化后，收集悬浮A549细胞，经细胞计数，用PBS 调整细胞密度为5×106个/ml，备用。

1.3 小鼠饲养及肺癌移植瘤模型建立 按照文献[5]中的方法，所有小鼠均置于室温（22.1±2.0）℃的环境中饲养，并设置12h 昼夜交替节律。经异氟烷吸入性麻醉后，用1ml 注射器抽取PBS 配制的5×106个A549 细胞，注入小鼠右前肢皮下，建立肺癌移植瘤模型。

1.4 分组与给药 接种7d 后，用游标卡尺测量肿瘤大小，并计算肿瘤体积，取肿瘤体积约50mm3的小鼠进行试验。按照随机数字表法将荷瘤小鼠分为对照组、雷公藤内酯醇组、4-PBA 组和4-PBA+雷公藤内酯醇组4组，每组8 只。雷公藤内酯醇组每日腹腔注射0.2ml（浓度为1μg/ml）雷公藤内酯醇+0.4ml 0.9%氯化钠注射液，4-PBA 组每日腹腔注射0.4ml（浓度为100μg/ml）4-PBA+0.2ml 0.9%氯化钠注射液，4-PBA+雷公藤内酯醇组每日注射0.2ml 雷公藤内酯醇和0.4ml 4-PBA，对照组给予腹腔注射等量的0.9%氯化钠注射液。所有小鼠每周监测肿瘤体积，于第21 天后采用断头法处死所有小鼠，剥下肿瘤组织，测量肿瘤体积和质量。

1.5 MDSC 比例检测 采用流式细胞术。按照文献[6]中的方法，处死荷瘤小鼠后，切开腹腔取出脾脏，置于含有1 000U/ml 青霉素、1 000U/ml 链霉素的PBS 中，经研磨、过滤、离心后收集细胞悬液，加入红细胞裂解液5ml，静置5min，再用PBS 稀释，以1 500r/min 离心5min，重复2 次，制成单细胞悬液。经计数，调整细胞浓度为5×106个/ml。取100μl 加入离心管中，加入CD16/CD32抗体，经PBS 洗涤2 次后，依次加入2μl PE-Cy5-Gr-1和2μl FITC-CD11b 抗体，避光孵育20min，上机检测。

1.6 重组人精氨酸酶1（ARG1）、一氧化氮合酶（iNOS）mRNA 表达检测 采用RT-qPCR 法。Trizol 法提取MDSC 总RNA，按照Takara 反转录试剂盒说明书步骤合成cDNA，接着进行按照SYBR Green 方法进行qPCR，反应体系 为25μl，采用2-ΔΔCt法分析ARG1 和iNOS mRNA 的表达量。使用GAPDH 作为内参照，引物系列如下：ARG1：正向5′-CCAGAAGAATGGAAGAGTCAGTGT-3′，反向5′-GCAGATATGCAGGGAGTCACC-3′；iNOS：正向5′-CACCAAGCTGAACTTGAGCG-3′，反向5′-CGTGGCTTTGGGCTCCTC-3′；GAPDH：正向5′-GACTTCAACAGCAACTCCCAC-3′，反向5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.7 MDSC 凋亡检测 采用流式细胞术。将荷瘤小鼠脾脏细胞悬液置于EP 管中，分别加入PE-Cy5-Gr-1 和FITC-CD11b 抗体，避光孵育20min，经PBS 洗涤2 次后，制成单细胞悬液，用Moflo XDP 超速流式细胞分选CD11b+Gr-1+细胞，置于含有10%FBS 的培养基中。取上述MDSC 细胞悬液，经计数，调整细胞数量为1×106/ml，离心并弃细胞上清液，加入500 μl 结合缓冲液，轻轻重悬细胞，依次加入5μl 膜联蛋白V 和5μl 碘化丙啶，轻轻混匀，室温下避光孵育15 min，上机检测。

1.8 Bcl-2、Bax、CHOP、GRP78 和PERK 表达检测 采用Western blot 法。取5×106个MDSC 细胞，加入细胞裂解液冰上裂解15min，12 000r/min 离心15min，吸取上清液。经二喹啉甲酸法定量后，取20μg 总蛋白4%～12%聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳分离，电转至聚偏氟乙烯膜上，3%脱脂牛奶室温封闭1h。加入一抗4℃孵育过夜，随后磷酸盐吐温缓冲液（PBST）缓冲液洗PVDF 膜3次，每次8 min，加入辣根过氧化物酶标记的第二抗体室温孵育1～2 h，再用PBST 缓冲液洗PVDF 膜3 次，每次8 min，增强化学发光试剂发光、显影和定影。并用image J 分析。

1.9 统计学处理 采用SPSS 22.0 统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4 组小鼠肿瘤体积和肿瘤质量的比较 与对照组相比，雷公藤内酯醇组和4-PBA+雷公藤内酯醇组在第21 天时肿瘤体积、肿瘤质量明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与雷公藤组相比，4-PBA 组和4-PBA+雷公藤内酯醇组肿瘤体积、肿瘤质量均明显增加，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与4-PBA 组相比，4-PBA+雷公藤内酯醇组肿瘤体积、肿瘤重量均明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表1。

2.2 4 组小鼠MDSC 比例及ARG1、iNOS mRNA 表达的比较 与对照组相比，雷公藤内酯醇组在第21 天时MDSC 比例和ARG1、iNOS mRNA 表达均明显下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与雷公藤内酯醇组相比，4-PBA 组和4-PBA+雷公藤内酯醇组MDSC 比例和ARG1、iNOS mRNA 表达均明显增加，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与4-PBA 组相比，4-PBA+雷公藤内酯醇组MDSC 比例和ARG1、iNOS mRNA 表达比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表2。

表1 4 组小鼠肿瘤体积和肿瘤质量的比较

表2 4 组小鼠MDSC 比例及ARG1、iNOS mRNA 表达的比较

2.3 4 组小鼠MDSC 凋亡率及Bcl-2、Bax 表达的比较 与对照组相比，雷公藤内酯醇组在第21 天时MDSC 凋亡比例增加，Bcl-2 表达下降，Bax 表达增加，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与雷公藤内酯醇组相比，4-PBA 组和4-PBA+雷公藤内酯醇组MDSC 凋亡比例下降，Bcl-2 表达增加，Bax 表达下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与4-PBA 组相比，4-PBA+雷公藤内酯醇组MDSC 凋亡、Bcl-2、Bax 表达比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见图1、表3。

图1 4 组小鼠Bcl-2、Bax 表达的电泳图

2.4 4 组小鼠MDSC CHOP、GRP78 和PERK 表达的比较 与对照组相比，雷公藤内酯醇组在第21 天时CHOP、GRP78 和PERK 表达均明显增加，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与雷公藤内酯醇组相比，4-PBA 组和4-PBA+雷公藤内酯醇组CHOP、GRP78 和PERK 表达均降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与4-PBA 组相比，4-PBA+雷公藤内酯醇组CHOP、GRP78 和PERK表达比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见图2 和表4。

表3 4 组小鼠MDSC 凋亡率及Bcl-2、Bax 表达的比较

图2 4 组小鼠MDSC CHOP、GRP78 和PERK 表达的电泳图

表4 4 组小鼠MDSC CHOP、GRP78 和PERK 表达的比较

3 讨论

雷公藤内酯醇是雷公藤发挥抗癌活性的重要成分之一[7-8]。近年来，研究证实雷公藤内酯醇的抗癌作用与其免疫调节作用有关。Tu 等[9]发现雷公藤能内酯醇的抗黑色素瘤作用与其能促进固有免疫应答有关。Hu 等[10]证实雷公藤内酯醇能显著增加卵巢癌移植瘤血清中炎症因子IL-2 和TIVF-α 的表达以及自然杀伤细胞细胞相关蛋白CD16 和CD56 的表达水平，提示雷公藤内酯醇的抗卵巢癌作用与其免疫调节有关。Chan 等[11]发现雷公藤内酯醇能够增加白血病小鼠T 细胞、B 细胞、单核细胞和巨噬细胞的数量，并促进巨噬细胞的吞噬功能。上述研究均说明了雷公藤内酯醇的抗癌作用与肿瘤免疫应答密切相关。

MDSC 是不同阶段髓系前体细胞分化受阻从而停留在各个分化阶段末的成熟粒细胞、巨噬细胞。在肿瘤微环境中，MDSC 分泌大量的的细胞因子（如iNOS、ARG1、转化生长因子-β、IL-10、前列腺素E2）抑制T 细胞免疫应答和固有免疫反应发挥免疫逃逸作用[12]。研究证实MDSC 与肺癌预后和治疗效果密切相关，有效解除MDSC 的免疫抑制作用有利于提高抗肺癌药物治疗效果[13]。因此，找到诱导抑制MDSC 的药物或者治疗手段从而提高肺癌治疗效果具有重要意义。本研究中，笔者发现雷公藤内酯醇可显著降低A549 肺癌荷瘤肿瘤体积和肿瘤质量，进一步证实了雷公藤内酯酮的抗肺癌作用，并且笔者还发现荷瘤小鼠经雷公藤内酯醇治疗后脾脏源性MDSC 比例降低，ARG1 和iNOS 表达水平下降，提示雷公藤内酯醇对肺癌源性MDSC 具有抑制作用，且这可能是雷公藤内酯酮抗癌作用的关键原因。

内质网应激是在细胞损伤条件下引起的抵抗性反应，当应激持续或强化时转而促进细胞凋亡，即内质网应激凋亡途径。研究证实内质网应激与MDSC 细胞凋亡密切相关[14-16]。内质网应激能够通过干扰素相关凋亡诱导受体激活DMSC 细胞凋亡，降低荷瘤小鼠MDSC比例[14]。MDSC 中活性氧、脂质沉积均处于较高水平，易于诱发细胞内质网应激的发生[15-16]。因此，内质网应激对MDSC 功能调节具有十分重要的作用。本研究中，笔者发现雷公藤内酯醇能够增加MDSC 细胞内质网相关蛋白CHOP、GRP78 和PERK 表达的作用，提示雷公藤内酯酮可能通过激活细胞内质网应激发挥抑制MDSC 作用。而且雷公藤内酯酮组细胞凋亡比率较对照组显著增加，提示雷公藤内酯醇可能激活内质网凋亡途径促进细胞凋亡。进一步研究发现，4-PBA+雷公藤内酯醇组细胞凋亡比例较雷公藤组显著降低、肿瘤体积和肿瘤质量显著增增加，说明内质网应激抑制剂4-PBA 显著减轻了雷公藤内酯醇诱发MDSC 细胞凋亡和抑制肿瘤生长的作用。然而，与4-PBA 组相比，4-PBA+雷公藤内酯醇组肿瘤体积、肿瘤质量明显下降，MDSC 细胞凋亡比例、ARG1、iNOS、CHOP、GRP78 和PERK 的表达均无增加，提示雷公藤内酯醇除了激活MDSC 内质网途径发挥抗肿瘤的分子机制外，还可能通过其他分子机制，值得进一步探索研究。

总之，本研究证实了雷公藤内酯醇能够通过激活MDSC 细胞的内质网应激，增加MDSC 凋亡，降低其免疫抑制活性，从而发挥抗肿瘤作用。