秦岭地区羊肚菌根系土样黏细菌的分离

王 军， 高 磊， 张 琨， 万 一*

(1.陕西省微生物研究所 分子生物学研究中心，陕西 西安 710043；2.陕西省科学院 秦岭天然产物工程中心，陕西 西安 710043)

黏细菌(Myxobacteria)是一类革兰阴性杆菌，能够滑行运动，生命周期内可以形成多细胞子实体。黏细菌具有许多明显的社会属性，它们以社会性的方式移动和捕食，这些过程需要特定的细胞间信号，展现出其复杂的生物间通讯水平。目前黏细菌有23个属，约60个种[1-2]。近三十年来，黏细菌被认为是具有多种生物活性次生代谢产物的宝贵生产者，黏细菌代谢产物具有许多独特的结构特征，以及稀有或新颖的作用方式，使它们成为药物开发中具有吸引力的先导结构[3-4]。近年来对于黏细菌的基因组测序和代谢谱分析表明，黏细菌次生代谢的多样性远远大于先前人们的预期[5]。秦岭作为我国生物多样性的典型地区，真菌资源丰富。羊肚菌(Morchella)是一类大型食药两用真菌，具有很高的营养价值和药用价值，在陕西省秦岭地区广泛种植[6]。羊肚菌生活史复杂，发生地环境多样。人工栽培时，播种后都需要覆盖往年发生过羊肚菌的土壤进行“覆土”操作，才能收获羊肚菌子实体[7]。有研究表明，较为丰富的细菌群落结构有利于羊肚菌的发生，这提示了羊肚菌发生时需要某些微生物的刺激，或者需要土壤中某些特殊物质的作用，而这些特殊物质又与土壤中微生物活动有关。熊川等[8]运用PCR-DGGE技术分析羊肚菌菌塘土壤细菌群落的结构与多样性，对采集于凉山州的野生羊肚菌的根系土样进行分析，结果显示羊肚菌根系土壤中存在Myxococcaceae(黏球菌科)，且占据一定的优势地位，但该类土样中黏细菌的分离纯化等工作尚未见报道。 鉴于此，有必要分离羊肚菌根系土样中的可培养黏细菌并分析其种类，为分析黏细菌与羊肚菌的生长是否存在某种联系提供依据，本研究采用不同诱导方法对羊肚菌根系土壤中的黏细菌进行分离鉴定，以期发掘羊肚菌等大型真菌根系土壤中的黏细菌资源并建立适宜的分离方法，为特殊生境的黏细菌资源研究开发提供思路，为评价黏细菌在羊肚菌发生中的影响提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土样 羊肚菌(Morchella)根系土样采自商洛市洛南县高耀镇前坪种植基地大棚，采集后立即风干，4 ℃保存备用。

1.1.2 菌种 大肠埃希菌(E.coli) CMCC 44102，由陕西省微生物研究所菌种资源中心提供。

1.1.3 培养基 WCX培养基、ST21 Agar培养基用于黏细菌的诱导，VY/2培养基用于黏细菌的纯化，LB培养基用于黏细菌的验纯，CAS液体培养基用于黏细菌的保存。

1.1.4 仪器和试剂 恒温培养箱(GH4500，天津泰斯特仪器有限公司)；宽视场体视显微镜(PXS，上海光学仪器五厂)；全温摇瓶柜(HYG-A，常州市国旺仪器制造有限公司)；PCR扩增仪(GeneAmp)。DNA marker、2×TaqPCR Master Mix、PCR胶回收试剂盒、T载体试剂盒均购自天根生化科技公司。

1.2 方法

1.2.1 黏细菌的分离纯化 ①土样的预处理 称取风干的土样10 g，研细，加入0.1 mg/mL的放线菌酮溶液浸泡过夜，以抑制真菌生长，离心后去除水层。②将培养至对数生长期的活的和死的大肠埃希菌分别涂布于WCX培养基上，将滤纸片和纤维素粉分别平铺在ST21 Agar培养基上，取豌豆大小土样分别放在诱导底物中央。30 ℃恒温培养，每天观察子实体的形成情况，连续观察一个月，以上述不同诱导底物对土样中的黏细菌进行诱导，比较出菌率[9-10](图1)。③分离的黏细菌纯化与保藏：当平皿上土样周围有黏细菌子实体形成时，在体视镜下挑取子实体并转接至VY/2培养基上，30 ℃培养，待长出子实体或薄膜状细胞后，反复转接至无杂菌生长。将纯化好的黏细菌挑取至LB液体培养基中震荡培养过夜，若培养基仍然澄清则说明无杂菌。将在平皿上生长至纯净单一的黏细菌接入到CAS冻存液中，-80 ℃保存[11]。

图1 培养基诱导底物Fig.1 Induced substrate of the culture mediums

1.2.2 菌株的分类鉴定 ①形态学鉴定：依据《Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology》(9thedition)的黏细菌分类标准，对分离的黏细菌菌落形态、细胞颜色、黏孢子和子实体形态进行观察，将分离到的黏细菌归类到属[12]。②分子生物学鉴定：采用CTAB法提取黏细菌总DNA，用细菌通用引物27F和1492R对黏细菌菌株的总DNA进行16S rRNA扩增，PCR产物进行测序，将所得序列结果在NCBI进行BLAST同源性比对，确定其归属[13-14]。

2 结果与分析

2.1 羊肚菌根系土样黏细菌的分离纯化

对比不同诱导底物对黏细菌的诱导效果(见图2)，活的大肠埃希菌能够诱导出较多的黏细菌子实体，平均每个平皿可以诱导出2～3种黏细菌子实体，而死的大肠埃希菌诱导效果相对较差，这可能与黏细菌具有的主动捕食习性有关。滤纸片和纤维素粉对黏细菌子实体的诱导效果没有显著差异，但滤纸片上的子实体在滤纸片表层，易于挑取，而纤维素粉上的子实体则与纤维素粉混在一起，不易挑取。

图2 不同底物诱导黏细菌效果Fig.2 The photos of different substrate inducing effects

不同底物诱导的出菌率见表1，以活的大肠埃希菌和滤纸片作为底物的培养基均能诱导出较多的黏细菌，其中活的大肠埃希菌的诱导效率最高。

表1 不同诱导底物的出菌率

本研究采用不同的大肠埃希菌诱导法和滤纸片诱导法，从6个羊肚菌根系土样中共诱导出28个黏细菌子实体，诱导出的部分子实体见图3。

图3 诱导的部分黏细菌子实体

A：黏球菌；B：黏球菌；C：珊瑚球菌；D：标桩菌；E：原囊菌；F：孢囊杆菌

A：Myxococcus；B：Myxococcus；C：Corallococcus；D：Stigmatella；E：Archangium；F：Cystobacter

经过反复纯化，目前得到17株黏细菌，部分菌株在VY/2平皿上的照片见图4。

图4 菌株Fig.4 The photos of the myxobacteriaA：标桩菌；B：黏球菌；C：珊瑚球菌；D：黏球菌；E：原囊菌；F：孢囊杆菌A：Stigmatella；B：Myxococcus；C：Corallococcus；D：Myxococcus；E：Archangium；F：Cystobacter

成熟的黏细菌的黏孢子大多呈圆球形、椭圆球形或不规则的团块状，直径在1～2 μm左右(图5)。

2.2 羊肚菌根系土样中黏细菌的外观形态观察

根据子实体、菌落形态和颜色等特征，以及16S rRNA基因序列比对结果，将上述菌株初步分为5个属，包括黏球菌属(Myxococcus)12株，珊瑚球菌属(Corallococcus)2株，孢囊杆菌属(Cystobacter)1株，原囊菌属(Archangium)1株，标桩菌属(Stigmatella)1株(表2)。分离结果说明羊肚菌根系土样中黏细菌资源具有一定的多样性，但主要以黏球菌属(Myxococcus)为主，这可能与本次采集的羊肚菌根系土样类型相似有关，土样中黏细菌的种类与羊肚菌的生长是否有相关性有待进一步研究。

图5 黏细菌黏孢子显微照片

A：黏球菌；B：孢囊杆菌；C：标桩菌；D：原囊菌；E：黏球菌；F：珊瑚球菌

A：Myxococcus；B：Cystobacter；C：Stigmatella；D：Archangium；E：Myxococcus；F：Corallococcus

表2 分离得到的黏细菌各属的形态特征

2.3 羊肚菌根系土样中黏细菌的分子鉴定

将分离得到的17株黏细菌的16S rRNA基因序列与NCBI数据库中的已知序列进行比对，找出亲缘关系最近的种属。从bacterio.cict.fr网站数据库中找到所得菌株模式菌株的16S rRNA序列，用Clustal X软件进行序列相似性分析和序列比对，用Mega 4.0的N-J法构建系统进化树。

如图6所示，可以将这17株菌分为3个大支，第1支是黏球菌属和珊瑚球菌属，第2支是孢囊杆菌属和原囊菌属，第3支是标桩菌属。分子鉴定的结果也表明16S rRNA不能完全将黏细菌的某些种类分开，因此对黏细菌的鉴定需要在分子鉴定的基础上结合形态学进行分类。

图6 分离菌株的系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree of the separated myxobacteria

3 讨 论

环境中绝大多数的微生物仍然是不可培养的，这表明微生物资源潜力巨大[15]，同时提醒我们仍有很多的工作需要完成。宏基因组测序技术的发展使研究人员能够了解环境中微生物种类及数量，但是对于可培养的微生物的性状以及生理生化特性的研究，仍然是微生物分类的依据，也是将丰富的微生物资源运用到生产实践中必不可少的方法[16]。黏细菌具有分布范围广、生长代时长、显著的社会性(如生长的细胞密度依赖、群体运动、群体捕食)等特点[17]。鉴于此，本研究对土样中的黏细菌进行定向分离。比较了不同诱导底物对土样中黏细菌子实体的诱导效果，结果显示以活的大肠埃希菌为诱导底物诱导土样中的黏细菌子实体效果最好，出菌率最高。

采用不同底物诱导法，对采集于秦岭商洛地区的羊肚菌根系土样中的可培养黏细菌进行分离，得到5个属共17株黏细菌，初步鉴定为黏球菌属12株，珊瑚球菌属2株，孢囊杆菌属1株，原囊菌属1株，标桩菌属1株[18]。分离结果说明羊肚菌根系土样所含的黏细菌资源以黏球菌属为主，这与采集的羊肚菌根系土样类型相似，以及黏球菌属黏细菌对环境的适应性强、易于培养等因素有关[19]。已有的研究结果表明，较为丰富的细菌群落结构有利于羊肚菌的发生，这暗示了羊肚菌发生时需要某些微生物的刺激，或者需要土壤中某些特殊物质的作用，而这些特殊物质又与土壤中微生物活动有关，黏细菌作为羊肚菌生长的菌塘土中的优势种群，很有可能是利于羊肚菌发生的细菌之一，其与羊肚菌生长的相关性及具体的作用机制还有待进一步研究[20]。

通过分析特殊生境下的黏细菌，如与某些植物或大型真菌中共生的黏细菌，可以增加获得新菌株及其相关代谢产物的概率，从而为得到活性黏细菌及其活性成分，开发黏细菌资源提供新的思路[21]。本研究拓宽了对羊肚菌根系中存在的可培养微生物的认识，作为来自新生境的黏细菌菌株，不仅丰富了黏细菌资源库，也可为进行其他特殊生境微生物的分离提供参考[22]。